Desenvolvimento de um modelo in vitro de infecção pelo vírus Zika em organoides cerebrais

Pegue uma placa multipoços contendo organoides cerebrais humanos em um meio de indução neural.

Os organoides contêm células-tronco, células gliais radiais, células progenitoras neurais ou NPCs e neurônios dispostos em um padrão radial chamado roseta, imitando o cérebro em desenvolvimento.

Remova o meio e lave os organoides com um tampão.

Adicione o vírus Zika suspenso em um tampão aos poços de teste e apenas tampão aos poços de controle.

Incubar, permitindo que o vírus se ligue a seus receptores nos NPCs e se torne internalizado.

Lave para remover vírus não internalizados, adicione um novo meio de indução neural e incuba.

Os vírus internalizados usam a maquinaria da célula hospedeira para formar novas partículas virais.

A multiplicação viral desencadeia uma resposta de estresse celular que induz a apoptose, reduzindo o número de NPCs disponíveis para o desenvolvimento de organoides.

Com o tempo, os organoides infectados exibem tamanho reduzido e morfologia interrompida, refletindo o desenvolvimento anormal do cérebro em humanos infectados pelo vírus Zika.

Leve a solução salina balanceada 1X da Earle, 1X PBS e o meio de indução neural a 37 graus Celsius em banho-maria. Em seguida, dilua o vírus Zika de uma concentração conhecida na solução de 1X Earle para a multiplicidade alvo de infecção, que normalmente está entre 0,1 e 10. Usando uma pipeta P200, remova cuidadosamente todo o meio de cada organoide e, em seguida, lave rapidamente os organoides com 200 microlitros de PBS 1X quente.

Ao remover o meio de cada poço, é fundamental que não se toque no organoide ou o sugue para dentro da pipeta. Isso pode causar danos irreparáveis ao organoide. Caso isso aconteça, é melhor descartar o organoide.

Em seguida, remova cuidadosamente todo o líquido restante de cada poço organoide usando uma pipeta P200 de canal único. Em seguida, adicione rapidamente 50 microlitros de 1x solução de Earle para uma infecção simulada ou solução de vírus Zika a cada poço. Certifique-se de que cada organoide esteja completamente submerso. Quando terminar, coloque a placa de volta em uma incubadora de 37 graus Celsius por duas horas.

Após a conclusão de uma exposição viral. Lave cada poço dos organoides com 200 microlitros de PBS. Deixe os organoides assentarem por 15 segundos e, em seguida, remova o PBS usando uma pipeta P200 de canal único. Finalmente, adicione 200 microlitros de meio de indução neural fresco a cada poço e coloque a placa de volta na incubadora.