Avaliação da viabilidade neuronal em uma cultura de neurônios cerebelares por meio de coloração dupla

Comece com uma placa de cultura tratada com um agente antimitótico que inibe o crescimento das células gliais, deixando principalmente os neurônios dos grânulos cerebelares e um pequeno número de células gliais.

Remova o meio e adicione lentamente solução salina tamponada com fosfato frio ou PBS para manter a viabilidade celular.

Substitua o tampão por uma mistura de coloração fria e incuba.

Esta mistura contém diacetato de fluoresceína ou FDA, um composto não fluorescente, e iodeto de propídio ou PI, um corante fluorescente impermeável à membrana.

A FDA se difunde nas células, onde a esterase funcional nas células vivas a converte em um composto fluorescente verde.

O PI entra nas células mortas através de membranas danificadas, liga-se ao DNA e emite fluorescência vermelha.

Remova a solução de coloração e adicione PBS frio para evitar que as células sequem.

Obtenha imagens fluorescentes para colorações FDA e PI e uma imagem de contraste de fase. Mescle as imagens FDA e PI.

Em seguida, compare esta imagem de fluorescência com a imagem de contraste de fase, que ajuda a excluir as grandes células gliais.

A fluorescência vermelha indica a morte neuronal, enquanto a fluorescência verde