Avaliação da viabilidade neuronal em uma cultura de neurônios cerebelares por meio de coloração dupla

Comece com uma placa de cultura tratada com um agente antimitótico que inibe o crescimento das células gliais, deixando principalmente os neurônios dos grânulos cerebelares e um pequeno número de células gliais.

Remova o meio e adicione lentamente solução salina tamponada com fosfato frio ou PBS para manter a viabilidade celular.

Substitua o tampão por uma mistura de coloração fria e incuba.

Esta mistura contém diacetato de fluoresceína ou FDA, um composto não fluorescente, e iodeto de propídio ou PI, um corante fluorescente impermeável à membrana.

A FDA se difunde nas células, onde a esterase funcional nas células vivas a converte em um composto fluorescente verde.

O PI entra nas células mortas através de membranas danificadas, liga-se ao DNA e emite fluorescência vermelha.

Remova a solução de coloração e adicione PBS frio para evitar que as células sequem.

Obtenha imagens fluorescentes para colorações FDA e PI e uma imagem de contraste de fase. Mescle as imagens FDA e PI.

Em seguida, compare esta imagem de fluorescência com a imagem de contraste de fase, que ajuda a excluir as grandes células gliais.

A fluorescência vermelha indica a morte neuronal, enquanto a fluorescência verde significa a viabilidade neuronal.

Comece a coloração misturando diacetato de fluoresceína a uma concentração final de 10 microgramas por mililitro e iodeto de propídio a uma concentração final de 50 microgramas por mililitro em 10 mililitros de PBS. Misture a solução FDA PI por vórtice e coloque no gelo. Coloque a placa de cultura no gelo.

Aspire cuidadosamente o meio de cultura sem tocar nas células com a ponta da pipeta. Em seguida, adicione lentamente o PBS frio. Aspire o PBS e, em seguida, adicione a solução de trabalho fria FDA PI ou FDA PI Hoechst. Coloque o prato no gelo por cinco minutos. Em seguida, depois de aspirar a solução de trabalho FDA PI ou FDA PI Hoechst, adicione PBS frio a cada poço.

Certifique-se de que o microscópio fluorescente esteja configurado corretamente. Detecte as emissões de fluorescência para FDA PI e Hoechst em 520, 620 e 460 nanômetros, respectivamente, usando um tempo de exposição entre 100 e 300 milissegundos e um ganho analógico de 2,8X. Depois de coletar imagens de fluorescência, tire uma imagem sob luz normal usando o modo Contraste de fase.

Para coloração dupla FDA PI, sobreponha as imagens das células arrastando a camada positiva para FDA sobre a camada positiva para PI no software de edição gráfica. Ajuste a opacidade da camada positiva para FDA inserindo 50% no campo de opacidade do painel Camadas. Mescle duas camadas abrindo o menu Camada e clicando no botão Mesclar visível. Defina o contraste das imagens sobrepostas inserindo 50 no campo de contraste em Imagem, Ajustes, Brilho/Contraste. Verifique se não há células duplamente positivas FDA e PI nas imagens de sobreposição.

Para a coloração tripla FDA PI Hoechst, sobreponha as imagens das células, novamente, arrastando a camada positiva para FDA na camada positiva para PI, ajustando a opacidade da camada positiva para FDA e mesclando as imagens como antes. Em seguida, arraste a camada positiva de Hoechst na camada mesclada.

Ajuste a opacidade da camada positiva de Hoechst inserindo 50% no campo de opacidade do painel Camadas e mescle as duas camadas abrindo o menu Camada e clicando no botão Mesclar visível. Distinguir visualmente células gliais grandes e irregulares de neurônios granulares cerebelares, comparando as imagens tiradas no modo Fluorescente com aquelas tiradas no modo Contraste de Fase.