Visualizando neurônios do corpo de cogumelo em cérebros de Drosophila via imunocoloração

Coloque os cérebros de Drosophila do tipo selvagem e mutante em uma solução contendo um fixador e um detergente. Incube com um balanço suave.

O fixador preserva a morfologia do tecido, enquanto o detergente permeia as membranas celulares.

Deixe o cérebro se assentar e remova a solução.

Lave os lenços com um tampão.

Adicione uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Remova a solução e adicione anticorpos primários direcionados a uma proteína específica que regula o desenvolvimento axonal nos neurônios do corpo do cogumelo do cérebro, ou MB.

Incubar para promover a ligação de anticorpos.

Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.

Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos anticorpos primários.

Lave novamente para remover os anticorpos não ligados e, em seguida, ressuspenda os cérebros em um meio de montagem.

Monte os cérebros em uma lâmina de ponte e visualize-os sob um microscópio de fluorescência.

Em comparação com o tipo selvagem, os cérebros mutantes exibem um fenótipo defeituoso, com projeções axonais incorretas e lobos MB ausentes.

Sob o microscópio, use uma pipeta P200 para transferir 10 a 15 cérebros dissecados no mesmo genótipo para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mililitro preenchido com paraformaldeído a 4% diluído em PTN. Em seguida, incube os cérebros por 20 minutos com balanço lento à temperatura ambiente. Após a fixação, permita que os cérebros se acomodem no fundo do tubo e, em seguida, remova o fixador.

Em seguida, faça duas lavagens rápidas com 500 microlitros de PTN por lavagem. Troque o PTN assim que os cérebros se acomodarem no tubo. Em seguida, execute três lavagens longas com PTN usando agitação suave à temperatura ambiente.

Após essas lavagens, os cérebros podem ser armazenados durante a noite a 4 graus Celsius em PTN. Depois de remover a última lavagem de PTN, incube os cérebros em 0,5 mililitros de solução de bloqueio por pelo menos 30 minutos em temperatura ambiente e com agitação suave. Depois de remover a solução de bloqueio, adicione os anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio e incube os cérebros a 4 graus Celsius por dois dias com agitação suave.

Remova o anticorpo primário usando o regimento de lavagem PTN de 5 lavagens e, em seguida, aplique os anticorpos secundários. Permita que esses anticorpos incubem com os tecidos por três horas em temperatura ambiente, protegidos da luz com balanço.

Depois de incubar os cérebros na solução de anticorpos secundários, aplique o regimento de lavagem PTN, cobrindo as amostras com papel alumínio após cada lavagem, e termine removendo o máximo de tampão possível. Em seguida, adicione 75 microlitros de meio de montagem fluorescente anti-desbotamento e flua os cérebros e o meio para dentro e para fora da ponta da pipeta apenas uma vez. O tubo pode ser então embrulhado em papel alumínio e armazenado a 4 graus Celsius por vários dias, mas o ideal é prosseguir diretamente com a montagem.

Para montar os cérebros, construa um escorregador de ponte. Posicione duas lamínulas de base com cerca de 1 centímetro de distância em uma lâmina carregada positivamente. Certifique-se de que o slide carregado positivamente esteja voltado para cima. Em seguida, cole as lamínulas na lâmina com esmalte e deixe o esmalte secar completamente antes de prosseguir.

Em seguida, coloque a lâmina sob um estereomicroscópio e pipete os cérebros e o meio no espaço entre as lamínulas. Certifique-se de ajustar a iluminação para melhorar a visualização dos cérebros.

Em seguida, aspire a mídia de montagem extra da lâmina, tomando cuidado para evitar os cérebros. Em seguida, remova o excesso de mídia de montagem restante. Isso permitirá que os cérebros sejam posicionados com mais precisão.

Agora, usando fórceps, oriente os cérebros em um padrão de grade com seus lobos antenais voltados para cima. Em seguida, coloque uma lamínula sobre os cérebros e use esmalte para selar as bordas da lamínula superior que estão presas às lamínulas de base. Agora, carregue a cavidade central com um novo meio de montagem gota a gota, permitindo que o meio seja puxado sob a lamínula por ação capilar. Quando a cavidade estiver preenchida, sele-a completamente com esmalte transparente.