Induzindo neuroinflamação em larvas de peixe-zebra com injeção de lipopolissacarídeo

Pegue as larvas de peixe-zebra anestesiadas em um prato forrado com gel de agarose e certifique-se de que o cérebro esteja voltado para cima para a injeção.

Posicione o prato sob um microscópio para visualizar os ventrículos cerebrais, que são cavidades cheias de líquido dentro do cérebro em desenvolvimento.

Pegue uma agulha de microinjeção contendo uma solução de lipopolissacarídeos, ou LPS, um componente bacteriano para desencadear uma resposta imune.

Posicione a agulha acima do tectum cerebral, uma região que contém neurônios e células imunes residentes, particularmente a microglia.

Perfure o cérebro com a agulha e injete a solução de LPS no ventrículo.

A microglia no tecido circundante se liga ao LPS por meio de receptores toll-like.

A ligação desencadeia a liberação de citocinas pró-inflamatórias, que recrutam neutrófilos para o local, levando à neuroinflamação.

Os neutrófilos geram explosões de espécies reativas de oxigênio e liberam enzimas proteolíticas, resultando na morte neuronal.

Transfira as larvas induzidas por neuroinflamação para um meio de cultura para mantê-las para ensaios a jusante.

Configure o micromanipulador de modo que a ponta da agulha do aparelho de microinjeção fique no mesmo campo de visão que as larvas em alta ampliação. Derreta uma solução de agarose a 2% em água bidestilada usando um micro-ondas. Despeje a agarose derretida em um prato de plástico. Use uma pipeta de transferência de plástico para transportar as larvas anestesiadas para o centro de um prato de plástico revestido de agarose a 2%.

Oriente as larvas montadas com o lado do cérebro voltado para cima para acesso à agulha. Ajuste a ampliação do microscópio para que a estrutura ventricular do cérebro do peixe-zebra seja claramente exibida no campo de visão. Coloque a agulha cuidadosamente acima do tectum cerebral. Limpe a área do cérebro com etanol a 70% e perfure a pele do cérebro do peixe-zebra com a ponta da agulha lentamente usando o micromanipulador.

Pressione o pedal para ejetar um nanolitro de 1X PBS ou diferentes concentrações de lipopolissacarídeo. Transfira as larvas para um meio E3 limpo imediatamente após a injeção.