Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:51 min. • July 8th, 2025
Faça culturas microgliais em uma placa de vários poços contendo meio.
Substitua metade do meio no poço de teste por meio contendo nanopartículas de prata e no poço de controle por meio do veículo. Incubar.
A microglia internaliza as nanopartículas, é ativada e libera citocinas pró-inflamatórias.
Transferir o meio do veículo e o meio condicionado que contém estas citocinas para filtros instalados nos tubos de recolha.
Centrifugue para remover as nanopartículas, retendo as citocinas.
Inverta os filtros em novos tubos de coleta, centrifugue e colete a mídia. Adicione novas mídias.
Em seguida, faça culturas neuronais hipotalâmicas.
Substitua metade do meio do poço de controle por meio do veículo e o meio do poço de teste por meio condicionado. Incubar.
As citocinas se ligam a receptores nos neurônios hipotalâmicos, ativando vias de sinalização que induzem a morte neuronal.
Adicione a resazurina e incube.
Em células vivas, as enzimas desidrogenase reduzem a resazurina fracamente fluorescente a resorufina fluorescente.
Meça a fluorescência.
A fluorescência reduzida indica aumento da morte neuronal hipotalâmica, sugerindo neurotoxicidade induzida por nanopartículas.
Para começar, colete 200 microlitros de meio sobrenadante de cada poço da placa e carregue-o em um filtro que removerá as nanopartículas, colocado sobre um tubo de microcentrífuga.
É importante lembrar que, ao filtrar as nanopartículas, seu tamanho, forma e concentração afetarão a eficiência da filtração, por isso é aconselhável testar a filtragem com antecedência.
Agora, gire os tubos a 14.000 g em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, descarte o fluxo, que contém as nanopartículas, e coloque os filtros de cabeça para baixo em novos tubos de coleta. Gire os filtros de cabeça para baixo a 1.000 g por dois minutos para coletar o meio concentrado e condicionado contendo citocinas.
Em seguida, aumente o volume da coleção para 400 microlitros com DMEM suplementado recém-feito e armazene os tubos no gelo. Para este ensaio, estabelecer células hipotalâmicas a partir de estoques congelados usando os mesmos métodos descritos para estabelecer culturas microgliais. Por fim, use-os para semear placas de fundo transparente de paredes pretas com 5.000 células por poço em 200 microlitros de DMEM suplementado.
Após 24 horas de cultivo, remova 100 microlitros de meio e substitua-o por 100 microlitros de meio filtrado e concentrado coletado das culturas de células microgliais ativadas. Em seguida, incube a placa por 24 horas em condições padrão. No dia seguinte, adicione 22 microlitros de reagente de resazurina a cada poço e continue a incubação por 20 minutos. Em seguida, com um espectrofotômetro multimodo, faça uma medição de fluorescência para estimar a viabilidade da célula em termos de unidades de fluorescência relativa.