Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:46 min. • July 8th, 2025
Faça criossecções de tecidos craniofaciais embrionários fixos de camundongos compreendendo células da crista neural.
Lave as seções em tampão contendo um detergente não iônico para remover o meio de inclusão e permeabilizar as membranas, permitindo o acesso aos alvos intracelulares.
Adicione solução de bloqueio para saturar locais de ligação não específicos.
Remova o excesso de solução de bloqueio. Em seguida, incube com anticorpos primários direcionados a antígenos nucleares, como fatores de transcrição e marcadores de proliferação.
Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.
Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para se ligar aos anticorpos primários ligados ao antígeno.
Remova os anticorpos não ligados usando tampão.
Adicione um meio anti-desbotamento com um corante nuclear fluorescente e cubra com uma lamínula.
O corante mancha os núcleos e o meio antidesbotamento protege os sinais fluorescentes durante a imagem.
Visualize as seções sob um microscópio de fluorescência para avaliar a expressão e localização do marcador nuclear, indicando a proliferação de células da crista neural e a atividade de sinalização.
Enxágue as lâminas em PBST a 0,1% três vezes por cinco minutos cada, para lavar a OCT e permeabilizar as seções. Adicione 200 microlitros de solução de bloqueio a cada lâmina e incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova a solução de bloqueio sem enxaguar a lâmina. Adicione 100 microlitros de anticorpo primário diluído em solução de bloqueio a cada lâmina e incube durante a noite a 4 graus Celsius.
Enxágue as lâminas com PBS três vezes por 10 minutos cada em temperatura ambiente. Adicione 100 microlitros de anticorpo secundário diluído em solução de bloqueio e incube por uma hora em temperatura ambiente, protegido da luz. Enxágüe em PBS três vezes por 10 minutos cada em temperatura ambiente, ainda protegido da luz. Para montar os slides, adicione duas gotas de meio anti-fade com DAPI em cada slide. Cubra com uma lamínula e guarde a 4 graus Celsius até que esteja pronto para a imagem.