Avaliação da integridade estrutural das junções neuromusculares do músculo longitudinal dorsal em Drosophila

Comece com Drosophila thoraces de tipo selvagem e transgênico quimicamente fixados em um tampão.

Nos torácios transgênicos, as junções neuromusculares dos músculos longitudinais dorsais contêm neurônios que expressam uma proteína mutante que induz a neurodegeneração.

Remova o tampão e congele rapidamente os toráceos para evitar danos aos tecidos durante a bissecção.

Adicione tampão fresco e transfira os torácios para placas de dissecação.

Posicione o lado ventral do tórax para cima e remova os aglomerados de células nervosas para expor a linha média.

Bissetriz ao longo da linha média para obter hemitórax.

Remova o excesso de tecido.

Incube os hemitórax em um tampão de bloqueio para permeabilizar as membranas e evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Adicione anticorpos conjugados com fluoróforo direcionados a uma glicoproteína expressa em neurônios NMJ e filamentos de actina muscular.

Remova os anticorpos não ligados.

Organize os hemitórax em uma lâmina de ponte, adicione mídia de montagem e monte os tecidos.

Visualize sob um microscópio.

Em comparação com o tipo selvagem, os mutantes apresentam coloração neuronal reduzida, indicando neurodegeneração, enquanto os músculos exibem fluorescência intacta.

Antes de iniciar as bissecções, coloque luvas crioprotetoras e óculos de segurança e encha um frasco Dewar com nitrogênio líquido. Use um quebra-lâmina para agarrar uma lâmina de pena em um ângulo e dobre a lâmina para quebrar um pequeno pedaço. Use o quebra-lâmina para travar a lâmina na posição e use uma pipeta Pasteur de vidro para remover todo o PBS dos tubos de amostra.

Use uma pinça criogênica para submergir os tubos no frasco de nitrogênio líquido. Após 10 segundos, use uma pipeta Pasteur para adicionar aproximadamente 300 microlitros de PBS gelado a cada tubo no gelo e coloque um lado ventral do tórax para cima em uma placa de dissecção revestida com elastômero de silicone de 10 centímetros contendo PBS gelado. Use um par de pinças cegas para posicionar o tórax e um par fino de pinças para remover alguns dos gânglios torácicos para expor a linha média do tórax.

Usando a linha média do tórax como guia, use a lâmina para fazer um corte raso em um terço do tórax e use a pinça romba para posicionar o tórax em um ângulo de 45 graus. Use a lâmina para cortar diretamente a linha média do tórax para obter dois hemotórax e faça cuidadosamente um ou dois cortes para remover o excesso de tecido sem danificar os músculos longitudinais dorsais. Em seguida, coloque as amostras de tecido muscular em um tubo de PBS devidamente marcado.

Quando todas as amostras de tórax tiverem sido divididas ao meio, permeabilize os tecidos em tampão de bloqueio por pelo menos uma hora a 4 graus Celsius. No final da incubação, vortex solução de corante estrutural recém-preparada e adicione 150 microlitros da mancha a cada amostra para uma incubação de duas horas em um rotador em temperatura ambiente no escuro. Após a coloração, lave as amostras em PBST e coloque cinco etiquetas de reforço empilhadas e cortadas ao meio, separadas por 15 mililitros, em uma lâmina de microscópio de vidro.

Use uma ponta de micropipeta modificada para transferir os tórax para cada lâmina e use um lenço de laboratório para remover qualquer excesso de PBST. Use uma pinça para organizar as amostras de forma que os tórax fiquem voltados para o lado muscular para cima. Quando as amostras estiverem orientadas corretamente, use uma ponta de pipeta de 200 microlitros para aplicar 70 microlitros de meio de montagem em cada lâmina e cubra cada lâmina com uma lamínula. Em seguida, use esmalte para revestir generosamente as bordas externas das lamínulas para obter uma vedação completa ao redor de cada tecido.