Investigando uma lesão cerebral larval de peixe-zebra usando microscopia eletrônica de transmissão de varredura em larga escala

Pegue seções cerebrais ultrafinas quimicamente fixadas e embebidas em resina de larvas de peixe-zebra saudáveis e com lesões cerebrais montadas em uma grade de um orifício.

As seções são coradas com metais pesados para melhorar o contraste da imagem durante a imagem microscópica.

Coloque a grade em um porta-amostras e transfira-o para a câmara de microscopia.

Alinhe a grade sob o canhão de elétrons, que gera um feixe de elétrons.

Uma série de lentes e bobinas eletromagnéticas concentra o feixe de elétrons nas seções.

Mova o suporte de amostra para digitalizar as seções em um padrão raster.

À medida que o feixe de elétrons passa pelas seções de tecido, as regiões densas de elétrons coradas espalham mais elétrons, enquanto as regiões não coradas transmitem os elétrons.

O detector coleta esses sinais de elétrons, criando imagens cerebrais de alta resolução.

Comparado ao controle, o cérebro lesado mostra microglia fagocítica contendo numerosas inclusões intracelulares, uma característica da neurodegeneração induzida por lesão.

Para montar a amostra no microscópio eletrônico de varredura ou SEM, coloque a grade da caixa de transferência com a seção no suporte de amostra de grade múltipla e transfira-a para a câmara do SEM. Depois de alinhar o detector de acordo com o protocolo de texto, pré-irradie a amostra diminuindo o zoom para que toda a área a ser digitalizada se ajuste à janela da imagem. Depois que a abertura for alterada para 120 micrômetros e a imagem for desfocada, use a opção de varredura de área reduzida para tornar a área digitalizada o mais apertada possível.

Em seguida, defina a taxa de quadros para verificar um quadro em aproximadamente 1 a 2 segundos. Em seguida, aumente o zoom em pelo menos 100x e escaneie uma pequena área por dez segundos. Se o brilho na área ainda mudar, continue a pré-irradiação. Quando esta área não muda de brilho em comparação com o ambiente, a pré-irradiação é suficiente.

Enquanto estiver focado, selecione a área ou recurso mais claro e defina a velocidade de digitalização para que os detalhes fiquem visíveis. No software do microscópio, ajuste o brilho e o contraste observando cuidadosamente o histograma para manter todos os pixels na faixa dinâmica. Faça o mesmo para as áreas e recursos mais escuros. Volte para a área clara e verifique novamente para que haja algum espaço em ambos os lados do histograma.

Para as etapas 4-6 a 4-8, o ajuste do brilho e do contraste deve ser feito com muito cuidado para que toda a área esteja dentro da faixa dinâmica.

Diminua o zoom para que toda a área a ser digitalizada se ajuste à janela de imagem e inicie o programa de aquisição de grandes áreas. Em seguida, use a opção Assistente para configurar um mosaico selecionando uma área na tela.

Use um tamanho de pixel de 2 a 5 nanômetros, dependendo de quais detalhes são necessários, e defina um tempo de permanência de três microssegundos para microscopia eletrônica de transmissão de varredura ou STEM. Pressione Otimizar para verificar as configurações do microscópio e o tempo necessário será exibido. Em seguida, ligue o gerador de varredura externo novamente e pressione Continuar.