Geração de Organoides Neuronais Dopaminérgicos a partir de Células-Tronco Embrionárias Humanas

Pegue células-tronco embrionárias humanas, ou hESCs, em um frasco revestido com matriz extracelular.

Substitua o meio por um meio de indução neural e incuba, diferenciando hESCs em colônias de células progenitoras neurais, ou NPC.

Adicione solução enzimática para dissociar as colônias.

Centrifugue, remova o sobrenadante e ressuspenda as células em um meio de indução com fatores de crescimento para apoiar a diferenciação de NPC.

Adicione a suspensão celular em micropoços inversos em forma de pirâmide para formar neuroesferas tridimensionais.

Transfira neuroesferas para uma placa revestida de matriz extracelular contendo um meio de diferenciação com fatores de crescimento e pequenas moléculas. Incubar sob agitação para promover a diferenciação em neurônios progenitores dopaminérgicos.

Substitua o meio por meio de maturação neural e coloque as neuroesferas em um disco de membrana em uma inserção de poço de cultura, permitindo a difusão de ar e nutrientes.

Incubar sob condições estáticas para formar organoides tridimensionais que consistem em neurônios dopaminérgicos maduros.

Esses organoides, imitando um cérebro em desenvolvimento, são úteis para estudar a degeneração dos neurônios dopaminérgicos, uma característica da doença de Parkinson.

Substitua o meio de células-tronco usado para manter as características de pluripotência das hESCs, por um meio sem soro contendo coquetel de inibição SMAD duplo para iniciar a indução neural e inibidor de ROCK 10 micromolar para aumentar a taxa de sobrevivência das células durante a passagem no dia seguinte. No primeiro dia, prepare a placa de micropoços com 2,5 mililitros por poço de meio livre de soro contendo a mesma concentração de inibidor de ROCK e moléculas duplas de inibição de SMAD.

Para diferenciar as células em direção ao padrão ventral do tubo neural, adicione SHH e FGF8 a 100 nanogramas por mililitro e dois agonistas micromolares suavizados. Depois de adicionar o meio, centrifugue a placa a 1.200 vezes g por cinco minutos para remover as bolhas de ar dos micropoços. Quando a placa de micropoços estiver pronta para uso com meio meio diferenciador, remova o meio de hESCs e lave rapidamente com PBS sem cloreto de cálcio e magnésio.

Dissocie as colônias em uma suspensão unicelular adicionando 7,5 mL de solução enzimática recombinante em um frasco T75. Incube as células por dois minutos a 37 graus Celsius e, em seguida, adicione 7,5 de DMEM F-12. Em seguida, recolher a suspensão celular e centrifugar a 300 vezes g durante cinco minutos. Em seguida, remova o sobrenadante e conte as células no mesmo meio usado para preparar a placa de micropoços.

Ajuste o volume do meio para obter uma suspensão celular, permitindo formar neuroesferas contendo 1.000 células por micropoço, preparando 4,7 milhões de células em 2,5 mililitros de meio, e adicionando-o aos 2,5 mililitros anteriores de meio já colocados na placa. Para distribuir corretamente as células em cada micropoço, agite suavemente a placa e centrifugue-a a 300 vezes g por cinco minutos. Em seguida, incube a placa a 37 graus Celsius por 24 horas para gerar esferas.

No segundo dia, lave suavemente os micropoços com meio e transfira as esferas em uma placa de seis poços tratada com tecido. Coloque as esferas em rotação a 37 graus Celsius e troque metade do meio por meio fresco a cada dois ou três dias. Nos dias 3 a 13, para melhorar a indução neural e converter em progenitores neurais com uma identidade no mesencéfalo, suplemente o meio com três inibidores micromolares de GSK-3-beta. Divida a amostra em duas novas placas de seis poços tratadas com tecido para reduzir a densidade da esfera e evitar a agregação da esfera.

No oitavo dia, inicie a maturação neural mudando para um novo meio com fatores de crescimento e troque o meio a cada dois ou três dias. No dia 21, coloque uma inserção de placa de cultura em um poço de uma nova placa de seis poços e adicione 1,2 mililitros de meio de maturação neural usado para diferenciação de neuroesferas sob a inserção da membrana. Em seguida, deponha a membrana de PTFE em uma inserção de placa de cultura.

Finalmente, para gerar o organoide neural, semeie cerca de 100 neuroesferas em condições de interface ar-líquido na membrana de PTFE. Pare a rotação a partir desta etapa e mude o meio a cada dois ou três dias até que o ponto de tempo de diferenciação necessário seja alcançado.