Modelagem de hemorragia induzida por drogas em larvas de peixe-zebra

Comece com uma placa de cultura contendo embriões de peixe-zebra fertilizados em um meio embrionário.

Posicione o prato sob um microscópio estéreo e use uma pinça de dissecção para remover o córion, a membrana externa que envolve os embriões.

Isso permite que os embriões sejam expostos ao meio circundante.

Transfira esses embriões descorionados para um prato contendo meio embrionário com uma droga que inibe a síntese de colesterol, que é crucial para manter a integridade dos vasos sanguíneos do cérebro.

Incube a uma temperatura controlada até que os embriões se desenvolvam em larvas.

Com o tempo, a droga permeia as larvas em desenvolvimento, inibindo a síntese de colesterol.

A deficiência de colesterol enfraquece os vasos sanguíneos do cérebro, fazendo com que eles se rompam e vazem sangue para o cérebro, desenvolvendo manchas hemorrágicas.

Observe as larvas sob um microscópio estéreo.

Separe as larvas hemorrágicas, com manchas vermelhas distintas, de uma população não hemorrágica.

Transfira essas larvas hemorrágicas para um novo prato para estudos adicionais.

24 horas após a fertilização, sob um estereomicroscópio de campo claro, use pinças de dissecção ultrafinas afiadas para descorionar embriões para tratamento com atorvastatina. Em seguida, adicione 30 mililitros de meio embrionário E3 a duas placas de Petri limpas, uma para tratamento e outra para controle. Remova 60 microlitros de água do embrião da placa de tratamento e adicione 60 microlitros de atorvastatina 0,5 milimolar para atingir 80% das larvas hemorrágicas.

Usando uma pipeta Pasteur, transfira 100 embriões com o mínimo de água possível para cada prato. Incube os dois pratos a 28 graus Celsius. A qualquer momento após 50 horas após a fertilização, sob o microscópio, use uma pipeta Pasteur para separar cuidadosamente os peixes hemorrágicos das populações não hemorragiadas e transfira as larvas para novos pratos contendo meios E3 frescos.

Para facilitar a separação de larvas positivas para hemorragia, você pode usar peixes sem pigmento ou peixes que expressam proteína fluorescente nos glóbulos vermelhos.