JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:27 min • July 8th, 2025
Pegue células-tronco neurais primárias e células progenitoras e neurônios, que têm sialoglicoproteínas marcadas por um repórter de ácido siálico.
Adicione paraformaldeído para fixar as células. Remova o excesso de paraformaldeído usando tampão.
Incube com uma mistura de reação contendo sondas químicas à base de biotina, um agente redutor e um catalisador à base de metal.
O agente redutor ativa o catalisador, facilitando a biotinilação das sialoglicoproteínas.
Remova a mistura de reação e lave com tampão. Adicione estreptavidina conjugada com fluoróforo para ligar as sialoglicoproteínas biotiniladas.
Remova a estreptavidina não ligada e lave com tampão. Adicione proteínas e um detergente não iônico para bloquear locais não específicos e permeabilizar as células.
Remova esta solução e incube com anticorpos primários direcionados a proteínas celulares específicas.
Remova os anticorpos não ligados.
Incube com anticorpos secundários marcados com fluoróforo e um corante fluorescente para ligar anticorpos primários ligados a proteínas e rotular os núcleos.
Remova as moléculas não ligadas. Lave com tampão.
Usando microscopia de fluorescência, obtenha imagens das células para visualizar as sialoglicoproteínas fluorescentes e as proteínas celulares.
Primeiro, remova as inserções das placas de cocultura e aspire o meio de cultura do fundo dos poços. Em seguida, lave as células neurais uma vez com PBS pré-aquecido. Aspire o PBS dos poços e adicione 1 mililitro de paraformaldeído a 4% pré-resfriado em PBS a cada poço.
Fixe as células em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, lave as células três vezes com PBS pré-resfriado. Aspire o PBS e adicione 1 mililitro de tampão conjugado com biotina recém-preparado em cada poço. Incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Depois disso, aspire o tampão de reação dos poços e lave as células três vezes com PBS. Adicione 1 mililitro de tampão de coloração a cada poço de células e incube em temperatura ambiente por 30 minutos.
Em seguida, aspire o tampão de coloração dos poços e lave as células três vezes com PBS pré-resfriado. Adicione 1 mililitro de tampão de bloqueio a cada poço de células e incube em temperatura ambiente por 10 minutos. Remova o tampão de bloqueio dos poços e adicione 1 mililitro de solução de anticorpo primário a cada poço. Incube as células durante a noite a 4 graus Celsius.
No dia seguinte, remova a solução de anticorpos primários dos poços. Lave as células três vezes com PBS pré-resfriado. Aspire o PBS dos poços e adicione 1 mililitro de anticorpo secundário a cada poço. Incube as células em temperatura ambiente por duas horas. Depois disso, aspire a solução dos poços e lave as células três vezes com PBS pré-resfriado.