Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:18 min. • July 8th, 2025
Comece com uma lâmina de cultura de vários poços contendo neurônios de um embrião de camundongo em um meio.
Os neurônios exibem cones de crescimento nas pontas de seus axônios em crescimento. Essas estruturas incluem projeções finas chamadas filopódios e extensões semelhantes a folhas chamadas lamelopódios, que consistem em filamentos de actina e microtúbulos, componentes do citoesqueleto.
Tratar os alvéolos de ensaio com proteína β amilóide agregada ou Aβ e os alvéolos de controlo com uma solução veículo.
Nos poços de teste, o Aβ agregado se liga aos receptores de membrana, iniciando a sinalização a jusante que fosforila as proteínas reguladoras do citoesqueleto.
As proteínas fosforiladas rompem os filamentos de actina e os microtúbulos, desestabilizando a integridade estrutural do cone de crescimento e causando seu colapso.
Incube com um fixador para preservar a estrutura celular, depois lave as células e monte-as para obter imagens.
Usando um microscópio, compare as estruturas celulares nos poços de teste e controle.
Uma ocorrência aumentada de colapso do cone de crescimento em neurônios tratados com Aβ indica o efeito tóxico dos agregados Aβ.
Comece este ensaio com pelo menos uma semana de antecedência, abrindo um novo frasco para injetáveis de A-beta-42 de comprimento total obtido comercialmente e dissolvendo o conteúdo em água destilada estéril a uma concentração de 0,5 milimolar. Incubar a 37 graus Celsius por sete dias para induzir agregação e toxicidade. Preparar alíquotas de A-beta-42 agregado e conservar a 80 graus Celsius negativos até à utilização.
No quarto dia da cultura neuronal, trate os poços com 100 microlitros de A-beta-42 agregado 0,5 micromolar ou solução veicular em meio B por uma hora, conforme demonstrado anteriormente. Após a hora, remova o meio de cultura e fixe imediatamente os neurônios com paraformaldeído a 4% contendo 4% de sacarose em PBS por uma hora a 37 graus Celsius em uma placa quente.
A fixação é mais importante, pois manter a forma dos cones de crescimento é fundamental para este protocolo.
Após a fixação, lave os neurônios três vezes com PBS. Em seguida, depois de remover a câmara, monte os neurônios com um meio de montagem aquoso. Seque o meio de montagem a 4 graus Celsius por dois a quatro dias. Capture toda a área de cada poço com uma lente objetiva seca de 20x em um microscópio invertido.
Capturar e analisar toda a área em cada poço é importante para evitar a subjetividade.
Classifique os neuritos mais longos de cada neurônio no estágio 3 ou 4 como axônios. Os cones de crescimento axonal sem lamelipódios ou possuindo menos de três filopódios são considerados cones de crescimento colapsados.