Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:59 min. • July 8th, 2025
Pegue uma lâmina de vidro contendo uma fatia cortical de tecido cerebral coletada de um paciente com Alzheimer. O tecido contém depósitos insolúveis de beta-amilóide dentro do parênquima e capilares cerebrais.
Mergulhe a lâmina em álcool diluído para remover lipídios e sais.
Lave com álcool absoluto para desidratar o tecido e, em seguida, aplique um fixador para preservar a arquitetura do tecido.
Seque a lâmina a vácuo, removendo qualquer umidade.
Trate com vapor de ácido fórmico em um ambiente umidificado para quebrar os agregados beta-amilóide em peptídeos solúveis menores.
Usando um scanner óptico, gere imagens das características estruturais do tecido para interpretar os dados da espectrometria de massa de imagem.
Pulverize uma solução de matriz sobre a amostra.
Usando um espectrômetro de massa, aplique um laser que a matriz absorve para ionizar os peptídeos. Um detector então os identifica com base em sua relação massa-carga.
Analisar os dados para produzir imagens, revelando a distribuição dos peptídeos beta-amiloides no parênquima tecidual e nos capilares cerebrais.
Para enxaguar as seções de tecido, mergulhe as amostras em 40 a 100 mililitros de etanol a 70% em um frasco de coloração de vidro por 30 segundos para remover lipídios endógenos e sais inorgânicos. Lave as amostras usando a sequência de lavagem listada no protocolo de texto. Em seguida, seque as amostras no vácuo por 30 minutos.
Agora, trate as seções de tecido com um vapor de ácido fórmico para uma melhor ionização das proteínas beta-amilóide do tecido cerebral da autópsia. Para isso, prepare o forno a 60 graus Celsius e uma travessa de vidro de incubação com 5 mililitros de ácido fórmico 100%. Mantenha a umidade do ar no prato de vidro de incubação no nível de saturação.
Coloque as lâminas de tecido na placa de vidro de incubação, evitando a submersão no ácido fórmico e trate por seis minutos. Tire uma imagem óptica das amostras usando um scanner de filme, scanner de gel ou um microscópio digital. Execute esta etapa em temperatura ambiente.
O alinhamento da imagem óptica das amostras é necessário quando o alvo da amostra é colocado dentro do instrumento. Normalmente, não será possível reconhecer a seção de tecido sob a camada da matriz. Para correlacionar as imagens ópticas com as amostras, faça marcas de guia visíveis na imagem óptica e abaixo da camada de matriz na óptica da câmera. A maneira mais fácil é identificar pelo menos três marcas de fluido de correção ao redor da amostra antes de tirar a imagem óptica.
Para pulverizar a matriz com um pulverizador ultrassônico, remova o tecido a ser pulverizado do dessecador e coloque-o na câmara. Certifique-se de que o tecido não esteja cobrindo a janela do sensor. Inicie a preparação pressionando o botão Iniciar. Normalmente, o tempo de preparação é de cerca de 90 minutos.
A preparação será regulada automaticamente através do monitoramento da espessura da camada de matriz e umidade. Alternativamente, para pulverizar a solução de matriz na superfície do tecido com um pulverizador automático, use um sistema de bomba de solvente ajustado para 10 PSI e 0,15 mililitros por minuto para fornecer a solução de matriz.
Um fluxo constante de gás de bainha aquecido será fornecido em conjunto com o spray de solução de matriz. Realize experimentos de imagem de alto rendimento e alta resolução espacial com o MALDI-IMS. Para medições de espectrometria de massa, defina as áreas do tecido usando o software de controle MALDI e o software de análise de dados.
Adquira espectros em um modo linear positivo com uma faixa de relação massa-carga de 2.000 a 20.000 e uma resolução espacial de 20 e 100 mícrons. Para fazer o padrão de calibração, dissolva o padrão de calibração de peptídeos no padrão de calibração de proteínas na proporção de 1 para 4 com CHCA em solução TA30 e, em seguida, dilua-o 10 vezes.
Coloque 1 microlitro de padrão de calibração na lâmina em quatro locais diferentes. Usando um software de histologia molecular, sobreponha várias imagens de sinal para encontrar a correlação espacial de vários sinais, como diferentes peptídeos beta-amilóide co-localizados em placas senis nas paredes arteriais.