Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:06 min. • July 8th, 2025
Micro-hemorragias cerebrais, ou CMHs, são sangramentos cerebrais neuroinflamatórios causados pela ruptura da barreira hematoencefálica, resultando no vazamento de glóbulos vermelhos, ou hemácias, para o tecido cerebral.
Para detectar CMHs, comece com tecido cerebral fixo de um rato com CMHs.
Mergulhe o tecido em sacarose para crioproteção.
Usando um criomicrótomo, corte o tecido e colete uma seção em uma lâmina de vidro.
Lave para remover o fixador residual.
Aplique o corante de hematoxilina ligado a um cátion metálico que interage com o DNA carregado negativamente, manchando o núcleo de roxo-avermelhado.
Siga com álcool-ácido para remover o excesso de corante e, em seguida, aplique um agente de azulamento alcalino para neutralizar o ambiente ácido e converter o corante em sua forma azul, aumentando o contraste.
Lave o tecido com álcool para melhorar a penetração da mancha e, em seguida, aplique eosina para manchar as hemácias de vermelho-laranja e os componentes do tecido de rosa.
Desidrate o tecido usando concentrações crescentes de álcool e limpe-o com xileno para visualização microscópica.
Capture imagens para detectar as hemácias vazadas de cor vermelho-laranja, confirmando CMHs.
Depois de isolar o cérebro, mergulhe-o em sacarose a 20% em PBS por pelo menos seis horas ou até que o cérebro afunde no fundo do tubo. Troque a solução para 30% de sacarose e corrija-a por mais seis horas.
Finalmente, prepare seções de tecido cerebral de 10 milímetros de espessura usando um criostato. Comece a coloração H&E lavando as lâminas em água destilada. Em seguida, mergulhe em solução de hematoxilina por oito minutos. Após a coloração, lave em água corrente da torneira por cinco minutos. Diferencie em álcool ácido a 1% por 30 segundos.
Depois de lavar em água corrente da torneira por um minuto, manche em água com amônia a 0,2% ou solução saturada de carbonato de lítio por 30 segundos a um minuto. Em seguida, lave em água corrente da torneira por cinco minutos. Contra-coloração com solução de eosina por 30 segundos a um minuto. Desidrate com álcool 90%, depois álcool 95% e álcool absoluto por 0,5 a 2 minutos cada.
Após a desidratação, limpe em xileno por 30 segundos. Após a montagem, analise a coloração H&E usando um microscópio de fluorescência de campo claro. Os glóbulos vermelhos liberados dos vasos sanguíneos, que são componentes dos CMHs, aparecem em vermelho-laranja sob a coloração H & E.