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Comece com uma lamínula contendo neurônios cultivados expressando proteínas da membrana da vesícula sináptica, incluindo sinaptofisina marcada com fluorescência e sinaptotagmina-1.
Remova o meio, adicione uma mistura de tampão de despolarização e anticorpos primários e incube.
Os íons tampão entram nas células, estimulando a fusão das vesículas sinápticas com a membrana, o que expõe a sinaptotagmina-1.
Os anticorpos primários ligam-se seletivamente à sinaptotagmina-1 exposta.
Descarte o tampão e lave com o meio para remover os anticorpos não ligados.
Introduza meio fresco e incube para facilitar a internalização da membrana, formando vesículas recicladas com sinaptofisina marcada e sinaptotagmina-1 ligada a anticorpos.
Remova o meio, fixe as células e lave.
Introduza um tampão de bloqueio à base de detergente com anticorpos secundários acoplados a fluoróforo.
O detergente permeabiliza as células, permitindo que os anticorpos secundários interajam com a sinaptotagmina-1 ligada ao anticorpo.
Levante a lamínula, lave-a com água e seque-a.
Coloque a lamínula virada para baixo em uma lâmina com um meio de incorporação para análise óptica das vesículas recicladas duplamente marcadas.
Pré-aqueça 600 microlitros de tampão de despolarização 1x e 10 mililitros de meio de cultura de células a 37 graus Celsius no banho-maria. Adicione 1 microlitro de anticorpo anti-SYT1 de camundongo ao tampão de despolarização 1x e vórtice por 10 segundos. Depois de remover e descartar o meio de cultura celular das células, adicione 200 microlitros da mistura de anticorpos de despolarização a cada poço.
Incube a placa por 5 minutos a 37 graus Celsius e 5% de CO2 na incubadora. Remova e descarte a mistura de anticorpos de despolarização e lave as células três vezes com meio de cultura celular. Adicione 1 mililitro de meio de cultura de células a cada poço e incube por 30 segundos em temperatura ambiente.
Em seguida, retire 750 microlitros de meio e adicione a mesma quantidade de meio fresco. Repita esse processo três vezes. Em seguida, remova e descarte o meio de cultura celular e adicione 300 microlitros de PFA a 4% em 1x PBS.
Finalmente, incube por 20 minutos a 4 graus Celsius antes de lavar três vezes por 5 minutos cada com 1x PBS. Dilua o anticorpo secundário acoplado a fluoróforo em 200 microlitros de tampão de bloqueio para cada poço em uma diluição de 1 a 1.000. Remova e descarte o PBS 1x de cada poço contendo lamínulas com os neurônios cultivados.
Adicione 200 microlitros de mistura de anticorpos tampão de bloqueio a cada poço e incube por 60 minutos em temperatura ambiente. Após a incubação, lave as células três vezes por 5 minutos com 1 mililitro de 1x PBS.
Em seguida, adicione uma gota de 7 microlitros de meio de incorporação na lâmina do microscópio. Remova a lamínula da placa de 24 poços levantando-a com uma cânula e agarrando-a com uma pinça. Mergulhe a lamínula em água destilada para remover o PBS e seque-a cuidadosamente tocando uma borda em um tecido mole.
Vire a lamínula na gota do meio de incorporação de modo que a superfície que transporta as células fique voltada para a lâmina do microscópio, incorporando assim as células no meio de incorporação. Deixe as lâminas secarem sob o capô por uma a duas horas, cobrindo-as para evitar a exposição à luz. Armazene as lâminas secas em uma caixa de lâminas de microscópio a 4 graus Celsius.