Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 4:53 min. • July 8th, 2025
Comece com uma lamínula contendo neurônios cultivados expressando proteínas da membrana da vesícula sináptica, incluindo sinaptofisina marcada com fluorescência e sinaptotagmina-1.
Remova o meio, adicione uma mistura de tampão de despolarização e anticorpos primários e incube.
Os íons tampão entram nas células, estimulando a fusão das vesículas sinápticas com a membrana, o que expõe a sinaptotagmina-1.
Os anticorpos primários ligam-se seletivamente à sinaptotagmina-1 exposta.
Descarte o tampão e lave com o meio para remover os anticorpos não ligados.
Introduza meio fresco e incube para facilitar a internalização da membrana, formando vesículas recicladas com sinaptofisina marcada e sinaptotagmina-1 ligada a anticorpos.
Remova o meio, fixe as células e lave.
Introduza um tampão de bloqueio à base de detergente com anticorpos secundários acoplados a fluoróforo.
O detergente permeabiliza as células, permitindo que os anticorpos secundários interajam com a sinaptotagmina-1 ligada ao anticorpo.
Levante a lamínula, lave-a com água e seque-a.
Coloque a lamínula virada para baixo em uma lâmina com um meio de incorporação para análise óptica das vesículas recicladas duplamente marcadas.
Pré
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