JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
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Comece com uma cultura de neurônios aderentes tratada com agregados de alfa-sinucleína ou alfa-S, que são aglomerados de uma proteína mal dobrada.
Esses aglomerados se agregam para formar inclusões intracelulares.
Substitua a mídia por uma solução de fixação para preservar a integridade celular.
Remova a solução de fixação e lave com tampão.
Em seguida, adicione um surfactante para permeabilizar a membrana celular.
Remova o surfactante e lave com tampão.
Introduzir uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
Agora, incube com anticorpos primários que se ligam especificamente a inclusões alfa-S e proteínas estruturais.
Lave com tampão para remover anticorpos não ligados.
Incubar com anticorpos secundários marcados com fluorescência.
Remova os anticorpos não ligados.
Adicione uma mancha fluorescente para rotular o núcleo.
Remova a mancha e lave com tampão.
Usando a mídia de montagem, monte a lamínula com neurônios em um slide.
Sob um microscópio fluorescente, observe inclusões alfa-S imunomarcadas dentro do neurônio.
Para realizar a imunofluorescência em uma capela química, fixar os neurônios com paraformaldeído a 2% em PBS e solução de sacarose a 5% por 15 minutos em temperatura ambiente sem agitação. Após 15 minutos, remova a solução de fixação e lave brevemente os neurônios com PBS três vezes.
Em seguida, permeabilize os neurônios com 0,3% de surfactante não iônico em PBS por 5 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, lave brevemente os neurônios com PBS três vezes. Incube os neurônios com 3% de FBS em PBS por 30 minutos à temperatura ambiente em um agitador orbital para bloquear locais de ligação inespecíficos. Em seguida, incube os neurônios com anticorpo primário apropriado dissolvido em 3% de FBS em PBS durante a noite na câmara fria ou na geladeira durante a noite a 4 graus Celsius em um agitador orbital.
No dia seguinte, remova a solução de anticorpos e lave as células brevemente com PBS por três vezes. Em seguida, incube os neurônios com o anticorpo secundário fluorescente apropriado dissolvido em 3% de FBS em PBS por 1 hora em temperatura ambiente no escuro em um agitador orbital.
Remova a solução de anticorpos e lave brevemente com PBS por três vezes. Em seguida, core os neurônios com solução de DAPI por 15 minutos em temperatura ambiente no escuro em um agitador orbital. Após 15 minutos, remova a solução de anticorpos e lave brevemente com PBS por três vezes. Monte as lamínulas no slide usando um meio de montagem anti-desbotamento.