JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:33 min • July 8th, 2025
Comece com uma placa sem fundo de vários poços presa a uma membrana de silicone. A membrana é revestida com um biopolímero para facilitar a adesão celular.
Introduza neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, ou hiPSCNs, suspensos em um meio nos poços. O meio é suplementado com matriz extracelular, ou proteínas ECM para aumentar a adesão celular.
Incubar a placa, permitindo que as células adiram às proteínas ECM e ao biopolímero, promovendo interação uniforme com a superfície da membrana.
Em seguida, prenda a placa no estágio de um dispositivo de lesão.
Usando o dispositivo, aplique recuo na membrana para gerar estresse mecânico controlado nos neurônios.
O estresse interrompe o citoesqueleto, o que causa a degeneração de saliências celulares denominadas neuritos e a formação de pequenos inchaços ao longo dos neuritos.
O estresse também danifica a integridade da membrana celular, resultando na morte celular.
Os hiPSCNs exibindo um fenótipo de lesão por estiramento estão agora prontos para análise.
Para esticar a placa, altere o campo "File name" e "File path" no instrumento virtual "Position Tracking" para um nome de arquivo exclusivo e clique na seta Executar. Defina a profundidade e a duração do recuo nos campos "Lesão" e "Duração da lesão" no instrumento virtual do painel de controle de movimento. Com a placa na posição zero, execute o instrumento virtual "Painel de controle de movimento" e clique em Ferir para recuar a placa.
Clique em Superior para mover o palco para cima, clicando em Parar quando a placa estiver na posição superior e abra a porta para desativar o dispositivo de lesão. Em seguida, inspecione o histórico de deslocamento do estágio apresentado no instrumento virtual "Position Tracker" para confirmar se o deslocamento máximo especificado foi aplicado e exporte os dados para um programa de planilha apropriado.
Para avaliar o estiramento da membrana de silicone após o tratamento com plasma, coloque a placa em uma superfície macia e aplique a pequena saliência em um carimbo com tinta de um marcador permanente. Insira o carimbo no primeiro poço a ser testado e bata para garantir uma boa transferência de tinta. Quando todos os poços tiverem sido stamped, coloque uma câmera de alta velocidade em um suporte de lança sobre o dispositivo de lesão, com a lente ajustada para o menor número F-stop para que o campo de view contenha 12 penetradores em uma grade de 3 por 4.
Com a placa na posição do ponto zero, clique no botão Gravar no software da câmera para que ele leia "Trigger In" e acenda a luz axial difusa e brilhante, depois recue a placa como acabamos de demonstrar e desligue a luz axial.
Para ferir uma cultura de células, adicione 100 microlitros de neurônios derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos tratados com laminina a cada poço da placa tratada com plasma e deixe as células se ligarem ao fundo da placa por 15 minutos em temperatura ambiente, antes de colocar a placa na incubadora de cultura de células. Após 2 a 3 dias de cultura, prenda a placa no estágio do dispositivo de lesão e ajuste a posição da tampa para prender a placa sem expor as culturas ao ar ambiente. Em seguida, com a placa na posição de ponto zero, recue a placa conforme demonstrado.