Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:30 min. • July 8th, 2025
Pegue uma placa multipoços contendo células de mamíferos transfectadas.
Essas células expressam o receptor odorífero (OR) do neurônio olfatório, um receptor acoplado à proteína G, juntamente com um biossensor de cAMP contendo um domínio de ligação de cAMP fundido a uma luciferase mutante.
Remova o meio e lave com tampão para remover o meio residual.
Adicione um tampão contendo um substrato de biossensor cAMP. Incubar para facilitar a absorção do substrato nas células.
Usando um leitor de placas de quimioluminescência, meça a luminescência basal das células.
Adicione concentrações crescentes do odor de teste aos poços, deixando um poço sem tratamento como controle.
O odorante se liga à sala de cirurgia e desencadeia uma cascata de sinalização que produz cAMP.
Este cAMP se liga ao domínio de ligação do biossensor, ativando a luciferase, que interage com o substrato para emitir luz.
Meça a luminescência em tempo real. Um aumento na luminescência com concentrações mais altas de odorante indica ativação da OR pelo odorante.
Antes da estimulação, observe as células transfectadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência adequada de 50% a 80% por poço antes de
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