JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:30 min • July 8th, 2025
Pegue uma placa multipoços contendo células de mamíferos transfectadas.
Essas células expressam o receptor odorífero (OR) do neurônio olfatório, um receptor acoplado à proteína G, juntamente com um biossensor de cAMP contendo um domínio de ligação de cAMP fundido a uma luciferase mutante.
Remova o meio e lave com tampão para remover o meio residual.
Adicione um tampão contendo um substrato de biossensor cAMP. Incubar para facilitar a absorção do substrato nas células.
Usando um leitor de placas de quimioluminescência, meça a luminescência basal das células.
Adicione concentrações crescentes do odor de teste aos poços, deixando um poço sem tratamento como controle.
O odorante se liga à sala de cirurgia e desencadeia uma cascata de sinalização que produz cAMP.
Este cAMP se liga ao domínio de ligação do biossensor, ativando a luciferase, que interage com o substrato para emitir luz.
Meça a luminescência em tempo real. Um aumento na luminescência com concentrações mais altas de odorante indica ativação da OR pelo odorante.
Antes da estimulação, observe as células transfectadas sob um microscópio de contraste de fase para garantir uma confluência adequada de 50% a 80% por poço antes de retornar à incubadora. Em seguida, prepare o meio de estimulação adicionando 10 HEPES milimolares e 5 milimolares de glicose à solução salina balanceada de Hank. Descongele alíquotas de 55 microlitros de alíquotas de substrato de substrato de ensaio AMP cíclico em tempo real no gelo.
Prepare a solução de equilíbrio a 2% misturando 55 microlitros do reagente substrato e 2.750 microlitros de meio de estimulação. Depois de espalhar uma espessa camada de toalhas de papel na bancada, bata suave e repetidamente o prato de cabeça para baixo nas toalhas de papel para que o meio de transfecção seja absorvido pelas toalhas de papel. Lave as células pipetando 50 microlitros de meio de estimulação para cada poço.
Bata suave e repetidamente no meio de estimulação da placa de 96 poços. Pipete 25 microlitros de solução de equilíbrio a 2% em cada poço e incube em temperatura ambiente no escuro por 2 horas. Antes do final do tempo de incubação, diluir as soluções de estoque de odor descongeladas até a concentração de trabalho no meio de estimulação.
Antes da adição de odor, use um leitor de placa de quimioluminescência para medir o nível de luminescência basal da placa. Remova rapidamente a placa do leitor de placas e adicione 25 microlitros das diluições de odor a cada poço. Em seguida, inicie imediatamente a medição contínua da luminescência de todos os poços por 20 ciclos em 30 minutos.