Medindo os níveis de ácido retinóico em neuroesferas usando uma linha celular repórter de ácido retinóico

Faça uma cultura aderente de células repórteres de ácido retinóico (AR).

Essas células carregam uma construção transgênica contendo o gene lacZ, que codifica a β-galactosidase, regulada pelo elemento de resposta ao ácido retinóico (RARE).

Sementes de células dissociadas derivadas de neuroesferas de células-tronco da medula espinhal de camundongos. Incubar.

As células da neuroesfera liberam RA, que entra nas células repórter e se liga ao seu complexo receptor em RARE.

Isso desencadeia a formação de um complexo ativador transcricional, iniciando a expressão da β-galactosidase.

Substitua o meio por um fixador para preservar a morfologia celular.

Remova o fixador e lave com um tampão.

Adicione um tampão de permeabilização para permeabilizar as membranas celulares.

Introduza um substrato de β-galactosidase e incuba.

O substrato entra nas células repórteres, onde a β-galactosidase o hidrolisa em um produto instável que oxida e dimeriza, formando um precipitado de cor azul.

Lave com um tampão.

Usando um leitor de microplacas, meça a absorbância e compare-a com uma curva padrão para quantificar a secreção de AR das células da neuroesfera.

Para co-culturas de neuroesferas, comece com a tran