Infusão cerebral estereotáxica direta de proteínas beta-amilóide para um modelo de doença de Alzheimer

Comece com um camundongo anestesiado com o crânio exposto. O camundongo é preso em uma estrutura estereotáxica contendo uma seringa pré-preenchida com proteínas beta-amilóide propensas à agregação.

Marque o bregma, um ponto de referência chave para determinar as coordenadas de infusão de proteínas.

Mova a seringa e toque no bregma, depois no lambda, para determinar as coordenadas dorsais-ventrais, garantindo a profundidade precisa da agulha.

Reposicione a seringa acima da coordenada médio-lateral predeterminada, visando o giro denteado, crucial para o processamento da memória.

Toque a superfície do crânio, garantindo que a coordenada dorsal-ventral esteja dentro do limite, e marque-a. Repita este procedimento no lado oposto.

Perfure a coordenada médio-lateral marcada, injete as proteínas beta-amilóide no giro dentado e segure para evitar o refluxo.

Perfure e injete proteínas beta-amilóide no lado oposto para uma dispersão uniforme da proteína.

Separe as barras auriculares do mouse e suture a incisão.

Com o tempo, as proteínas beta-amilóide se agregam para formar placas que degradam os neurônios do giro dentado e interrompem o processamento da memória, resultando na doença de Alzheimer.

Faça uma incisão de 2 a 3 milímetros na linha média do couro cabeludo com um bisturi. Use uma tesoura reta e fina para estender a linha de incisão até cerca de 1,0 centímetros para expor a sutura sagital, bregma e lambda do crânio. Depois disso, use uma pinça para separar a pele.

Limpe o crânio com um cotonete estéril embebido em solução salina estéril. Em seguida, use um cotonete limpo e seco para secar o crânio. Em seguida, marque um ponto no bregma. Posicione a seringa Hamilton usando o micromanipulador de forma que a ponta da agulha toque apenas o ponto no bregma. Em seguida, grave a coordenada DV.

Marque um ponto no ponto lambda. Certifique-se de que o eixo AP do crânio esteja nivelado movendo a seringa posteriormente para o ponto lambda. A ponta da agulha deve tocar o ponto lambda como fez com o ponto bregma. Depois disso, grave a posição DV. As coordenadas DV para bregma e lambda devem estar dentro de 0,5 milímetros.

Agora, retorne a ponta da agulha para o ponto bregma. Registre a posição inicial do AP. Em seguida, calcule a posição AP final subtraindo 2 milímetros da coordenada AP inicial e reposicione a agulha da seringa para a coordenada AP final.

Em seguida, registre a coordenada de ML atual. Calcule as coordenadas ML finais esquerda e direita adicionando ou subtraindo 1,3 milímetros da coordenada ML inicial e mova a agulha da seringa para as coordenadas ML finais. Toque a ponta da agulha na superfície do crânio em ambas as coordenadas ML finais e certifique-se de que as coordenadas DV estejam dentro de 0,5 milímetros.

Enquanto estiver na coordenada ML final, puxe a agulha 0,5 a 1 centímetro acima do crânio. Marque um ponto no crânio com um marcador de ponta extrafina de cor escura. Repita esta etapa para o lado contralateral do crânio. Em seguida, afaste a seringa.

Faça um furo na coordenada ML esquerda ou direita no crânio usando uma broca de 0,8 milímetro. Repita esta etapa para o lado contralateral. Depois, mova a seringa para um dos orifícios recém-introduzidos. Abaixe a agulha logo após o crânio e tome cuidado para não perfurar o cérebro.

Para garantir que a agulha tenha passado pelo crânio, empurre suavemente a agulha contra o crânio para garantir que a agulha não saia do orifício. Em seguida, registre a coordenada DV inicial. Calcule a coordenada DV final subtraindo 2,2 milímetros da coordenada DV inicial e abaixe a agulha até a coordenada DV final.

Em seguida, ajuste a bomba injetora estereotáxica para infundir 4 microlitros de Aβ_1-42 no giro dentado a uma taxa de 0.5 microlitros por minuto. Após a perfusão, deixe a agulha permanecer no lugar por mais um minuto para minimizar o refluxo da solução para fora do local da injeção. Depois disso, mova a agulha para o outro lado do cérebro e repita o procedimento.

Agora, desaparafuse as barras auriculares. Use uma pinça de padrão padrão de estudante para fechar o couro cabeludo e selar a ferida com uma sutura. Retire o protetor de nariz e remova o mouse.