Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:58 min. • July 8th, 2025
Pegue um trato gastrointestinal de camundongo embrionário transgênico fixo no estágio de desenvolvimento desejado.
O sistema nervoso entérico do trato gastrointestinal inclui neurônios entéricos e colinérgicos que expressam colina acetiltransferase.
Esses neurônios colinérgicos também expressam uma proteína fluorescente impulsionada pelo promotor da colina acetiltransferase.
Incube o trato com um detergente não iônico e proteínas para permeabilizar as células e evitar a ligação inespecífica de anticorpos.
Substitua por anticorpos primários. Incube para que os anticorpos se liguem às suas proteínas-alvo nos neurônios, respectivamente.
Remova os anticorpos não ligados e lave com tampão.
Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo para ligar especificamente os anticorpos primários ligados às proteínas-alvo.
Remova o excesso de anticorpos e lave com tampão.
Mergulhe o trato rotulado em meios de montagem contendo um corante nuclear para corar os núcleos. Agora, monte uma lamínula.
Usando microscopia confocal, visualize e analise a distribuição de neurônios colinérgicos no trato gastrointestinal.
Coloque os tratos gastrointestinais em um tubo de 0,2 mililitro contendo solução de bloqueio, consistindo de 1x PBS, 3% de albumina de soro bovino, 0,1 Triton X-100 e balance por 1 hora em temperatura ambiente. Após o bloqueio, aspirar a solução de bloqueio com uma pipeta de ponta fina de Pasteur e substituí-la pela diluição óptima dos anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio.
Incube por quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 graus Celsius na plataforma de balanço. Após a incubação primária do anticorpo, aspire a solução de anticorpos e enxágue os tratos gastrointestinais em PBS três vezes por cinco minutos cada e depois por uma hora em temperatura ambiente com balanço.
Após a última lavagem, substitua o PBS por anticorpos secundários conjugados com fluoróforo diluídos em solução de bloqueio e coloque os tubos na plataforma de balanço no escuro por quatro horas em temperatura ambiente ou durante a noite a 4 graus Celsius.
Depois de lavar os tratos gastrointestinais como antes, coloque algumas gotas de mídia de montagem de fluorescência com DAPI em uma lâmina de vidro e, em seguida, mergulhe o trato gastrointestinal no meio de montagem e adicione uma lamínula. Por fim, capture imagens de cada fluoróforo usando um microscópio confocal e, em seguida, execute a análise de imagem auxiliada por computador usando o software apropriado.