Uma injeção de vetor viral na substância negra do rato para modelagem de doenças neurodegenerativas

Prenda um rato anestesiado em um quadro estereotáxico.

Desinfete o couro cabeludo e faça uma incisão na linha média do crânio para expor o crânio.

Identifique o bregma e o lambda, dois pontos de referência no crânio, para determinar o local da injeção.

Prepare uma seringa para microinjeção contendo uma suspensão de vetor viral.

O vetor viral carrega um transgene que codifica a alfa-sinucleína, uma proteína que sofre desdobramento e agregação nos neurônios da substância negra em doenças neurodegenerativas.

Posicione a seringa no instrumento estereotáxico conectado a uma bomba de microinjeção.

Crie um orifício de rebarba no local da injeção, evitando lesões cerebrais.

Penetre na dura-máter com uma agulha e limpe qualquer sangue com tecido estéril.

Insira a agulha de microinjeção através do orifício da rebarba para alcançar a substância negra.

Injete lentamente a suspensão viral, garantindo uma distribuição uniforme.

Faça uma breve pausa para evitar o refluxo e, em seguida, retire lentamente a agulha.

Suturar a incisão.

O modelo agora está pronto para uma análise mais aprofundada.

Comece anestesiando adequadamente uma rata Wistar fêmea de oito semanas de idade, de acordo com os protocolos aprovados. Verifique se um plano cirúrgico de anestesia foi alcançado apertando cada pata e observando a ausência do reflexo de retirada. Em seguida, use um implantador de microtransponder para colocar um microtransponder nas costas do rato. Verifique se o microtransponder está posicionado corretamente e se uma leitura pode ser obtida.

Agora corte o cabelo no couro cabeludo do rato e aplique anestésico local no couro cabeludo e nas orelhas. Transfira o rato para uma capela de fluxo laminar e execute o resto do procedimento usando técnica asséptica. Coloque o rato na estrutura estereotáxica prendendo as barras auriculares, seguidas pela barra da boca e do nariz. Cubra o corpo do rato com um cobertor de papel para evitar uma queda na temperatura corporal. Aplique um lubrificante ocular para evitar que os olhos sequem.

Em seguida, desinfete o couro cabeludo de acordo com os procedimentos aprovados. Iodo a 1% em isopropanol a 70% é usado aqui. Depois de fazer uma pequena incisão na linha média do couro cabeludo, raspe suavemente as membranas do crânio e enxágue com solução salina. Depois de deixar o crânio secar, certifique-se de que bregma e lambda possam ser vistos claramente.

Agora, encha uma seringa de microinjeção de 10 microlitros, calibre 30 e 20 milímetros com AAV recombinante e coloque-a na bomba de microinjeção motorizada conectada ao instrumento estereotáxico.

Para a transdução específica dos neurônios dopaminérgicos da substância negra, os vetores AAV recombinantes são a primeira escolha devido aos seus altos títulos e eficiência na transdução de neurônios dopaminérgicos.

Teste o fluxo liberando uma gota de AAV. Descarte qualquer AAV liberado em um detergente de limpeza polivalente. Verifique visualmente se a cabeça está fixada diretamente na estrutura da cabeça. Em seguida, verifique se o crânio está plano movendo primeiro a ponta da agulha para bregma e medindo a altura neste ponto abaixando a ponta da agulha na direção dorsoventral, até tocar o crânio. Repita o procedimento em lambda.

Depois de retornar a agulha ao bregma, mova a agulha na direção ântero-posterior e mediolateral para as coordenadas estereotáxicas para microinjeção. Anote as coordenadas. No local da injeção, meça a altura do crânio como antes e certifique-se de que não difere mais de 0,3 milímetros da altura do bregma.

Em seguida, faça um furo de 2 milímetros no crânio. Uma vez feito o furo, meça a altura da dura-máter para determinar a referência a partir da qual aplicar a coordenada dorsoventral. Penetre na dura-máter usando uma agulha de calibre 26. Absorva qualquer sangue com um tecido estéril e prossiga somente depois que todo o sangramento tiver parado.

Agora, abaixe lentamente a agulha da seringa de microinjeção pré-carregada no cérebro até a coordenada ventral dorsal e faça uma pausa por um minuto. Em seguida, injete três microlitros de AAV a uma taxa de 0,25 microlitros por minuto. Após a injeção, deixe a agulha permanecer no lugar por mais cinco minutos para evitar o refluxo ao longo do trajeto da agulha antes de removê-la lentamente.

Costure o couro cabeludo usando poliéster trançado revestido 3.0 e desinfete a pele com iodo a 1% em isopropanol a 70%, para soltar a barra do nariz e da boca e, em seguida, as duas barras auriculares para remover suavemente o animal do instrumento estereotáxico. Neste momento, administre analgesia e, se necessário, um agente de reversão da anestesia. Em seguida, coloque o rato em uma gaiola limpa em uma placa de aquecimento ajustada para 38 graus Celsius e monitore de perto até que ele acorde.