Isolamento de agregados de proteínas insolúveis em detergente do tecido cerebral humano post-mortem

Comece com uma amostra de tecido cerebral humano post-mortem congelada de um caso confirmado de doença neurodegenerativa.

Consumir matéria cinzenta rica em agregados proteicos insolúveis, uma característica da doença.

Transfira o tecido para um homogeneizador.

Adicione um tampão contendo inibidores e homogeneize para liberar componentes intracelulares.

Os inibidores bloqueiam as enzimas protease e fosfatase, impedindo a degradação da proteína.

Transferir o homogeneizado para um tubo e adicionar um tampão detergente iónico. Incubar.

O detergente solubiliza proteínas dobradas nativamente, enquanto os agregados de proteínas mal dobrados permanecem intactos.

Sonicar para completar a dissociação celular.

Transferir o homogeneizado para um tubo de ultracentrifugação e centrifugar a alta velocidade.

Os agregados se depositam na parte inferior.

Remova o sobrenadante contendo proteínas solúveis em detergente.

Lave os agregados com um tampão detergente iônico, centrifugue e remova o sobrenadante.

Adicione tampão de ureia para desnaturar os agregados de proteínas, tornando-os solúveis.

Transferir os agregados de proteínas solubilizadas para um tubo e sonicar brevemente para assegurar a dissolução completa.

Obtenha tecido cerebral post-mortem congelado de controle saudável e DA confirmada patologicamente. Use uma pinça e uma lâmina de barbear para extirpar porções de aproximadamente 250 miligramas de substância cinzenta de cada amostra de tecido. Deixe o segmento cerebral descongelar por um minuto. Agora, corte um pedaço de tecido em pedaços cúbicos de aproximadamente dois milímetros enquanto ele descongela. Transfira para um tubo homogeneizador pré-resfriado de dois mililitros com gelo.

Lembre-se de evitar a substância branca e quaisquer vasos sanguíneos grandes.

Trabalhe rapidamente e coloque o lenço em barcos de pesagem descartáveis de lágrima. Tome cuidado para evitar que o tecido descongele, colocando frequentemente o barco de pesagem com tecido cerebral em recipientes de poliestireno com gelo seco. Depois de dissecar e pesar todos os pedaços de tecido necessários, remova um recipiente de pesagem contendo um pedaço de tecido do gelo seco.

Em seguida, adicione cinco mililitros de tampão de baixo teor de sal gelado com coquetel de inibidores de protease e fosfatase por grama de tecido e homogeneize no gelo usando aproximadamente 10 golpes de pilão A de alta folga e 15 golpes de pilão B de baixa folga. Em seguida, use uma pipeta Pasteur de vidro de nove polegadas para transferir cada homogeneizado para um tubo de polipropileno de dois mililitros rotulado. Aliquotar o homogeneizado restante em tubos adicionais rotulados de 1,5 mililitro de maneira semelhante para armazenamento a -80 graus Celsius.

Para prosseguir com o fracionamento, adicione 100 microlitros de cloreto de sódio de cinco molares e 100 microlitros de Sarkosyl a 10% a cada alíquota de 0,8 milímetro. Misture bem por inversão e, em seguida, incube no gelo por 15 minutos. Após a incubação, use um sonicador equipado com uma sonda de microponta para fornecer três pulsos de 5 segundos com amplitude de 30%.

Depois de usar o método do ácido bicinchonínico para determinar as concentrações de proteína dos homogeneizados, adicione tampão sark gelado com inibidores de protease e fosfatase a cada amostra até uma concentração final de 10 miligramas por milímetro. Em seguida, transfira 500 microlitros de cada amostra para tubos de ultracentrífuga de policarbonato de 500 microlitros.

Carregue os tubos em um rotor pré-resfriado e ultracentrifugue a 180.000 vezes g por 30 minutos a 4 graus Celsius. Após a centrifugação, transferir os sobrenadantes solúveis do sarkosil S1 para tubos de 1,5 mililitros e conservar a -80 graus Celsius. Adicione 200 microlitros de tampão sark aos tubos de ultracentrífuga contendo as frações P1 insolúveis em detergente e use a ponta da pipeta para desalojar os pellets do fundo dos tubos de ultracentrífuga.

Em seguida, transfira os pellets P1 ressuspensos para novos tubos de ultracentrífuga de 500 microlitros, balanceie em pares e centrifugue a 180.000 vezes g por mais 30 minutos a 4 graus Celsius. Descarte o sobrenadante S2 e, em seguida, adicione 50 a 75 microlitros de tampão ureia com coquetel de inibidores de protease e fosfatase aos pellets insolúveis em sarkosyl e incube por 30 minutos em temperatura ambiente para solubilizar o pellet P2.

Após a incubação, transfira os pellets P2 ressuspensos para tubos rotulados de 0,5 milímetros e solubilize totalmente os pellets usando uma breve sonicação de microtip de 1 segundo a 20% de amplitude. Determinar as concentrações proteicas das fracções solúvel e insolúvel em sarkosil utilizando o método do ensaio BCA.