Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:13 min. • July 8th, 2025
Pegue culturas de micro-ilhas de neurônios dopaminérgicos embrionários primários de camundongo em uma placa de vários poços contendo meio.
Esses neurônios são pré-tratados com fibrilas pré-formadas (PFFs) - formas mal dobradas e agregadas da proteína alfa-sinucleína.
Os PFFs atuam como sementes, desencadeando mais desdobramento e oligomerização da alfa-sinucleína endógena, formando fibrilas de alfa-sinucleína fosforiladas. Essas fibrilas eventualmente formam corpos de Lewy.
Substitua o meio por um fixador para preservar a morfologia celular.
Lave as células com tampão.
Introduza um tampão contendo detergente para permeabilizar as membranas celulares.
Adicione uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
Adicione anticorpos primários direcionados à alfa-sinucleína fosforilada e uma proteína de referência expressa de forma ubíqua em neurônios dopaminérgicos.
Lave para remover anticorpos não ligados.
Introduzir anticorpos secundários conjugados com fluoróforo direcionados aos respectivos anticorpos primários.
Lave novamente para remover os anticorpos não ligados.
Adicione um corante de ligação ao DNA para corar os núcleos.
Usando um scanner de placa de fluorescência, quantifique os neurônios dopaminérgicos contendo agregados citoplasmáticos de alfa-sinucleína.
Adicione 3,75 microlitros de 100 microgramas por mililitro de fibrilas pré-formadas a cada poço experimental e 3,75 microlitros de PBS a cada poço controle.
Ao trabalhar com PFFs, tenha cuidado com a contaminação indesejada de proteínas e, em seguida, limpe o capô e todos os instrumentos associados ao PFF com SDS a 1% e etanol a 70%.
No ponto final experimental apropriado, após a coloração dos marcadores de interesse, carregue a placa de cultura de 96 poços em um scanner de placa de alto conteúdo, equipado com uma objetiva de 10x. Ajuste as configurações de acordo com as especificações da placa de 96 poços, como tipo de placa, fabricante, tamanho, distância entre os poços e tipo e volume do meio.
Selecione a área de imagem dos poços para cobrir todas as células em cada micro ilha e use um poço para ajustar o foco automático na expressão DAPI. Calibrar o tempo de aquisição para cada canal fluorescente, com base na intensidade da coloração nos poços de controle, e ajustar os parâmetros para que as células de dopamina nos poços de controle tratados com fibrila pré-formada, abrigando agregados de fosfosserina 129 alfa sinucleína dentro do soma celular, sejam claramente distinguidas, permitindo uma quantificação inequívoca das células positivas e negativas de fosfosserina alfa sinucleína.
Em seguida, crie imagens de todos os poços selecionados simultaneamente em todos os canais, usando exatamente os mesmos parâmetros para cada poço.