JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:02 min • July 8th, 2025
Faça seções fixas de biópsia por sucção retal humana com antígenos proteicos expostos e peroxidases endógenas inativadas.
Adicione uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
Substitua a solução de bloqueio por anticorpos primários que se ligam à proteína alvo das células gliais, S-100, um marcador da doença de Hirschsprung.
Remova os anticorpos não ligados e incube com polímeros de peroxidase para amplificar o sinal.
Lave para remover o excesso de polímero. Adicione anticorpos secundários que se ligam a polímeros enzimáticos e anticorpos primários.
Remova os anticorpos não ligados e adicione um substrato cromogênico.
As peroxidases reagem com o substrato, formando um precipitado colorido.
Enxágue para remover o excesso de precipitado.
Adicione um corante para manchar os núcleos.
Lave com uma solução de ácido e etanol para remover o excesso de corante.
Em seguida, desidrate as seções usando concentrações crescentes de etanol seguido de xileno.
Finalmente, monte e observe ao microscópio para visualizar a coloração indicando a presença da proteína alvo.
Descarte o excesso de albumina sérica bovina e marque as células com 50 microlitros do anticorpo primário de interesse a 4 graus Celsius durante a noite. Na manhã seguinte, enxágue as lâminas com três lavagens de três minutos em PBS e adicione 50 microlitros de intensificador de polímero a cada lâmina. Após 20 minutos a 37 graus Celsius, lave as lâminas três vezes em PBS e adicione 50 microlitros de anticorpo secundário B a cada seção de tecido.
Após 30 minutos a 37 graus Celsius, enxágue as seções com três lavagens de cinco minutos em PBS e adicione uma gota de solução de trabalho DAB recém-preparada a cada lâmina. Quando o nível apropriado de coloração marrom for detectado por microscopia de luz, enxágue as lâminas em PBS por cinco minutos e contra-core os núcleos com uma gota de hematoxilina por um minuto.
Remova o excesso de mancha sob um fio de água por aproximadamente 30 a 40 segundos, seguido por uma lavagem de 25 a 30 segundos em PBS fresco. Diferencie os tecidos em etanol de ácido clorídrico a 1% por 10 segundos, seguido por uma lavagem de PBS de um minuto.
Desidrate as lâminas com imersões de cinco minutos na ordem inversa da hidratação e exponha as lâminas a duas trocas de xileno de cinco minutos. Em seguida, monte a lamínula usando uma montagem ultralimpa e deixe as lâminas secarem antes de serem visualizadas em um microscópio óptico.
Este artigo descreve um protocolo para coloração imuno-histoquímica de seções de biópsia retal humana para detectar a proteína S-100, um marcador associado à doença de Hirschsprung. O método envolve várias etapas, incluindo bloqueio, incubação com anticorpo e técnicas de visualização para destacar a presença da proteína-alvo.
A coloração imuno-histoquímica para a proteína S-100 em cortes de biópsia por sucção retal fornece um indicador robusto e quantitativo da presença de células gliais, apoiando diretamente a validação de alvos em neuropatias entéricas, como a doença de Hirschsprung. Este fluxo de trabalho permite a avaliação padronizada e reprodutível de amostras de tecido, facilitando a desvinculação biológica confiável e a comparabilidade entre estudos. A integração de marcadores validados desse tipo fortalece os processos de diagnóstico precoce e de pesquisa translacional em neurogastroenterologia.
Este protocolo de imuno-histoquímica insere-se na continuidade entre a fase de descoberta inicial e a validação pré-clínica, fornecendo um método padronizado para confirmação de alvos e biomarcadores em amostras de tecidos humanos.
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Última atualização: 29 agosto 2026