Induzindo lesão neuronal direcionada usando um laser de alta potência em uma larva de Drosophila

Coloque uma larva de Drosophila anestesiada com a cabeça erguida em uma gota de óleo em uma lâmina de vidro contendo manchas de graxa a vácuo.

Posicione uma lamínula e pressione-a suavemente para fazer contato com a larva.

Ajuste a larva para expor a região que contém os neurônios-alvo que expressam proteínas fluorescentes.

Prenda a lâmina em um microscópio de dois fótons.

Use um laser de baixa potência para minimizar os danos e escaneie a larva para localizar a região com os neurônios-alvo fluorescentes.

Em seguida, ajuste a janela de varredura para focar na região alvo que contém axônios, um tipo de projeções neuronais.

Agora, reduza a taxa de varredura e aumente a potência do laser.

O laser de alta potência atingirá os axônios alvo, gerando calor localizado que os danifica e aumenta a fluorescência ao redor do local da lesão.

Por fim, volte para o modo de laser de baixa potência. A presença de pequenas crateras, estruturas semelhantes a anéis no local da lesão confirma a lesão neuronal bem-sucedida.

Comece anestesiando as larvas. Em uma capela, coloque uma placa de vidro de 60 milímetros em uma placa de Petri de plástico de 15 centímetros. Em seguida, dobre um pedaço de papel de seda e coloque-o no prato de vidro. Colocar a placa de ágar uva sobre o tecido após a adição do éter dietílico. Em seguida, em uma lâmina de vidro, coloque uma gota de óleo halocarbono 27 no centro e coloque uma mancha de graxa a vácuo em cada um dos quatro cantos.

Em seguida, use uma pinça para transferir uma larva para a placa de ágar e cubra a placa de vidro para anestesiar a larva. Assim que a larva parar de se mover, transfira-a cuidadosamente para o óleo de halocarbono com a cabeça ereta. Em seguida, coloque uma lamínula sobre a lâmina e pressione-a suavemente, até que toque a larva. Em seguida, use uma força suave para deslizar a lamínula para rolar as células a serem ablacionadas para onde o laser de dois fótons as atingirá mais facilmente. A localização varia dependendo de quais neurônios estão sendo direcionados.

Agora, prenda a montagem no estágio do microscópio de dois fótons e concentre-se nas células de interesse usando uma objetiva de imersão em óleo de 40x. No software, alterne para o modo de varredura e carregue o protocolo salvo. Certifique-se de que o orifício esteja totalmente aberto. Em seguida, no modo Ao vivo, obtenha uma boa imagem da região de interesse. Em seguida, pare a verificação ao vivo, para que o botão Cortar fique disponível. Usando a função Crop, ajuste a janela de varredura para focar a área alvo apenas no local potencial da lesão.

Em seguida, abra uma nova janela de imagem. Agora, reduza a velocidade de varredura e aumente a intensidade do laser. Em seguida, alterne o botão contínuo para iniciar e parar a verificação. Observe com atenção. Assim que houver um aumento drástico na fluorescência, termine a varredura. Em seguida, volte para a janela de imagem original, selecione o modo Ao vivo e encontre a região que acabou de ser alvo ajustando o foco.

Uma boa indicação de lesão bem-sucedida é o aparecimento de uma pequena cratera, estrutura em forma de anel ou detritos localizados bem no local da lesão. Se a potência do laser fosse muito alta, uma grande área de dano seria visível, o que pode ser letal.