Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:19 min. • July 8th, 2025
Comece com uma cultura aderente de neurônios humanos maduros em uma placa revestida com matriz.
Adicione vetores lentivirais que codificam uma proteína tau humana mutante fundida a um repórter de proteína fluorescente amarela (YFP).
O lentivírus se liga a receptores específicos da superfície celular neuronal, permitindo a fusão da membrana viral-hospedeiro e a liberação de RNA viral e enzimas.
O RNA viral é transcrito reversamente em DNA.
A integrase viral transporta o DNA para o núcleo, facilitando a integração no genoma do hospedeiro e levando à produção da proteína tau mutante marcada com YFP.
Com o tempo, a tau mutante forma agregados citoplasmáticos nas células transduzidas.
Lave as células com meios frescos para remover partículas virais não internalizadas.
Continue a incubação com mudanças regulares de mídia para manter a viabilidade neuronal e promover a agregação de proteínas.
Visualize os neurônios sob um microscópio.
Os neurônios transduzidos com sucesso exibem agregados citoplasmáticos da proteína tau mutante fluorescente marcada com YFP.
Para transduzir neurônios com lentivírus, use uma contagem de títulos de 340.000 unidades transdutíveis por célula. Diluir as unidades transdutíveis nos meios de cultura de células até à concentração necessária e adicioná-las às células.
Dois dias após a adição do lentivírus, lave as células uma vez com meio fresco que não contenha bFGF.
Continue cultivando as células a 37 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono em meio sem bFGF. Mantenha as células por cerca de oito semanas após a transdução, certificando-se de trocar o meio de cultura celular a cada dois dias. Use um microscópio óptico para visualizar rotineiramente as células e garantir a viabilidade.