Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:59 min. • July 8th, 2025
Comece com células humanas geneticamente modificadas em um meio de crescimento.
Essas células contêm um sistema induzível por tetraciclina que possui a proteína precursora de amilóide ou gene APP e um gene de luciferase.
Trocar com um meio contendo tetraciclina e incubar.
A tetraciclina se liga à proteína ativadora, que se liga ao promotor da APP.
Isso induz a expressão gênica e produz as proteínas precursoras que se localizam na membrana celular.
A enzima β-secretase cliva a APP, gerando um fragmento que permanece ligado à membrana celular.
A γ-secretase cliva esse fragmento, produzindo peptídeos β amilóide e liberando um componente ativador.
Esse ativador entra no núcleo, liga-se ao promotor da luciferase, induz a expressão gênica e produz enzimas luciferase.
Substitua o meio por um reagente de ensaio contendo o substrato da luciferase. O substrato se difunde nas células e reage com a luciferase, produzindo bioluminescência.
Use um leitor de microplacas para medir a intensidade da luz, que reflete diretamente a atividade da γ-secretase, uma enzima crucial em condições neuropatológicas.
Conte as células NG ou CG com um hemocitômetro. Em seguida, semeie as células a 20.000 células
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