Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 2:59 min. • July 8th, 2025
Comece com células humanas geneticamente modificadas em um meio de crescimento.
Essas células contêm um sistema induzível por tetraciclina que possui a proteína precursora de amilóide ou gene APP e um gene de luciferase.
Trocar com um meio contendo tetraciclina e incubar.
A tetraciclina se liga à proteína ativadora, que se liga ao promotor da APP.
Isso induz a expressão gênica e produz as proteínas precursoras que se localizam na membrana celular.
A enzima β-secretase cliva a APP, gerando um fragmento que permanece ligado à membrana celular.
A γ-secretase cliva esse fragmento, produzindo peptídeos β amilóide e liberando um componente ativador.
Esse ativador entra no núcleo, liga-se ao promotor da luciferase, induz a expressão gênica e produz enzimas luciferase.
Substitua o meio por um reagente de ensaio contendo o substrato da luciferase. O substrato se difunde nas células e reage com a luciferase, produzindo bioluminescência.
Use um leitor de microplacas para medir a intensidade da luz, que reflete diretamente a atividade da γ-secretase, uma enzima crucial em condições neuropatológicas.
Conte as células NG ou CG com um hemocitômetro. Em seguida, semeie as células a 20.000 células por poço em microplacas de 96 poços com um volume final de 200 microlitros por poço em meio de crescimento. Transfira as microplacas para uma incubadora de dióxido de carbono umidificado e incube a 37 graus Celsius durante a noite. Após a incubação durante a noite, remova 100 microlitros de meio de crescimento de cada poço.
Adicione 100 microlitros por poço de meio de crescimento contendo 2 microgramas por mililitro de tetraciclina com 0,2% de dimetilsulfóxido, dois CL 387 micromolares, 785, dois DAPT micromolares ou outros inibidores de ErbB1 / ErbB2 relacionados. Incube as células tratadas em microplacas a 37 graus Celsius por 24 horas. Após a incubação, remova 150 microlitros por poço de meio de crescimento das microplacas.
Em seguida, adicione 50 microlitros por poço de reagente de ensaio de luciferase. Em seguida, transfira as microplacas para um leitor de microplacas de luminescência e mantenha-as em temperatura ambiente por cinco minutos. Determine a luminescência emitida pela luciferase do vaga-lume usando um programa predefinido armazenado no leitor de microplacas de luminescência.