Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:14 min. • July 8th, 2025
As regiões do locus coeruleus, localizadas bilateralmente no tronco cerebral do camundongo, contêm neurônios produtores de norepinefrina e regulam várias regiões do cérebro.
Para detectar essas regiões do locus coeruleus, comece com uma lâmina de vidro carregando as seções fixas e criopreservadas do tronco cerebral do camundongo.
Lave a lâmina com um tampão para remover vestígios de fixação.
Adicione um tampão contendo detergente e incube para permeabilizar as membranas e, em seguida, lave.
Introduzir anticorpos primários específicos para a enzima dopamina β-hidroxilase, que converte a dopamina em norepinefrina, um neurotransmissor.
Incubar para permitir que os anticorpos interajam com a dopamina β-hidroxilase.
Lave para remover anticorpos não ligados.
Em seguida, adicione anticorpos secundários acoplados a fluoróforos verdes e incube no escuro.
Os anticorpos secundários se ligam aos anticorpos primários e depois são lavados.
Adicione o meio de montagem às seções do cérebro, cubra e seque.
Observe as lâminas sob um microscópio de fluorescência.
A fluorescência verde que representa os neurônios produtores de norepinefrina marcados nas seções cerebrais indica a presença de regiões locus coeruleus.
No primeiro dia, lave as fatias de cérebro na placa de 24 poços 3 vezes por 5 minutos cada em PBS. Em seguida, adicione 0,5% de PBS com detergente e permeabilize-os a 4 graus Celsius por 24 horas.
No dia seguinte, lave as fatias três vezes por 5 minutos cada com PBSD a 0,5%. Em seguida, adicione o anticorpo primário em uma diluição de 1 a 500 em 0,5% de PBSD e incube a 4 graus Celsius por 18 horas.
No 3º dia, lave as fatias 3 vezes por 10 minutos cada com PBSD a 0,5%. Em seguida, adicione o anticorpo secundário em uma diluição de 1 a 1.000 em PBSD a 0,5%. Embrulhe a placa com papel alumínio e incube a 4 graus Celsius por 16 horas.
Após a incubação, lave as fatias 3 vezes por 5 minutos cada com 0,5% de PBSD e depois por 5 minutos em PBS. Cubra as seções usando um meio de montagem rígido sem DAPI. Cubra com uma tampa de vidro e seque por 30 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, use um microscópio confocal com configurações para detectar o sinal do comprimento de onda de fluorescência apropriado para obter imagens de fatias cerebrais.