Modelo de invasão tumoral baseado em matriz usando co-cultura de glioblastoma de microglia

Comece adicionando uma suspensão fria de glioblastoma e células microgliais, cada uma corada com um corante fluorescente distinto, em uma solução de matriz de polímero frio.

A condição fria impede a polimerização prematura da matriz.

Em seguida, transfira a mistura para uma inserção de câmara porosa dentro de uma placa de cultura.

Incubar para permitir a polimerização da matriz, formando um gel que incorpora as células.

Adicione meios sem soro ao inserto e meios de crescimento contendo soro ao poço abaixo e, em seguida, incube.

Os fatores químicos no soro promovem a migração celular em direção ao meio rico em soro.

Além disso, a microglia secreta moléculas de sinalização que interagem com as células do glioblastoma.

Isso aumenta a migração das células de glioblastoma para a parte inferior da inserção porosa, assemelhando-se à migração de um tumor para o tecido circundante.

Remova as células do topo da câmara.

Agora, fixe as células restantes com um fixador e lave-as com tampão. A fluorescência distinta das células ajuda a rastrear a migração celular.

Descongele a mistura de matrizes a quatro graus Celsius durante a noite. Em seguida, preparar uma concentração de 10 mg/ml de matriz no meio adequado sobre gelo. Em seguida, colha as células marcadas para suspensão na matriz, conforme mostrado anteriormente. Em seguida, pipete 1,5 vezes 10 para as quintas células GL261 em um volume de 150 microlitros, mais cinco vezes 10 para as quartas células da micróglia em 50 microlitros em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.

Adicione 2 vezes 10 às quintas células GL261 em um volume de 200 microlitros em um tubo de microcentrífuga separado de 1,5 mililitro. Gire as células em uma microcentrífuga por cinco minutos a 120 vezes g. Em seguida, ressuspenda as células em 200 microlitros de matriz fria no gelo.

Para esta etapa, é crucial ter uma bandeja de gelo pronta no capô. Mantenha os tubos nas pontas de gelo na geladeira. Certifique-se de que tudo esteja resfriado para evitar a polimerização prematura do gel maduro.

Após a ressuspensão, coloque 50.000 células em um volume de 50 microlitros no centro do compartimento superior de uma inserção de câmara de tamanho de poro de 8 mícrons. Em seguida, incube-o a 37 graus Celsius por 30 minutos para permitir que a polimerização ocorra. Após 30 minutos, adicione 200 microlitros de meio isento de soro à câmara superior e 700 microlitros de soro contendo meio de crescimento celular ao poço inferior.

Após incubação por 48 horas, remova as células da parte superior da câmara por aspiração suave. Fixe as câmaras como antes e substitua o fixador por 500 microlitros de 1X PBS antes de obter imagens das células.