Avaliação da resistência elétrica transendotelial em um modelo de barreira hematoencefálica in vitro

Comece com uma inserção de membrana contendo células endoteliais microvasculares do cérebro de camundongo, semelhante a uma barreira hematoencefálica in vitro.

Coloque este inserto em um poço de resistência elétrica transendotelial ou instrumento TEER contendo um eletrodo embutido.

Adicione mídia nova ao compartimento inferior.

Coloque a tampa com eletrodos sobre os poços TEER, coloque o instrumento em uma incubadora e conecte-o a um sistema de gravação.

Os eletrodos geram uma corrente elétrica através da camada celular para medição da resistência transendotelial.

Proteínas juncionais intactas entre as células impedem o fluxo de corrente, resultando em um valor TEER mais alto.

Desconecte o instrumento e remova-o.

Desmonte a tampa, remova um pouco do meio do compartimento superior e adicione células T pré-ativadas. Remonte o instrumento para medição TEER.

As células T ativadas interagem com as células endoteliais, liberando fatores inflamatórios e enzimas citolíticas, interrompendo a integridade juncional.

Essa interrupção aumenta o fluxo de corrente elétrica, resultando em um valor TEER mais baixo.

Para configurar a medição TEER, coloque o módulo de 24 poços do instrumento TEER na capela de fluxo laminar. Remova as tampas e coloque as inserções com MBMECs no instrumento usando uma pinça.

Em seguida, pipete 810 microlitros do meio fresco para o compartimento inferior dos poços do módulo. Adicione-o cuidadosamente entre a inserção e a parede do módulo. Depois disso, feche as tampas e coloque o instrumento na incubadora. Conecte o instrumento ao computador. Em seguida, ligue o controlador do instrumento e abra o software.

Na janela pop-up, selecione 'Nova medição'. Marque as caixas 'Mostrar TEER' e 'Mostrar Ccl' e pressione 'Iniciar'. Depois de concluir a primeira medição, selecione 'Verificar todos os poços' na guia 'resultados' para ver todos os valores de TEER e Ccl. Em seguida, salve o arquivo.

Em seguida, escolha o ponto de tempo para co-cultivar MBMECs com células T quando Ccl estiver estável e inferior a 1 microfarad por centímetro quadrado e TEER atingir seu nível máximo. Inspecione cuidadosamente os valores absolutos de TEER e Ccl e exclua os poços nos quais os MBMECs não desenvolveram monocamadas confluentes o suficiente, desmarcando esses poços.

Agrupe o restante dos poços clicando com o botão direito do mouse nos poços e selecionando 'Adicionar poço ao novo poço médio'. Nomeie-o na janela pop-up e faça o mesmo para todos os poços individuais a serem agrupados. Em seguida, verifique todos os poços médios para confirmar se todos eles têm as mesmas condições iniciais antes da co-cultura.

Na guia 'Experimento', pressione 'Pausar'. Desconecte o instrumento e retire-o da incubadora. Em seguida, remova as tampas da coifa de fluxo laminar. Em seguida, remova parte do meio do inserto no compartimento superior do poço. Adicione células T aos MBMECs pipetando cuidadosamente 150 microlitros de meio. Em seguida, reconecte o instrumento e pressione 'Retomar medição'. Após 24 horas, pressione 'Parar' na guia 'Experimento' e salve o arquivo.