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Neurociência
0 vistas • 2:58 min • July 8th, 2025
Pegue uma seção fixa do cérebro de camundongo contendo o núcleo basal de Meynert, rico em fibras nervosas que expressam a enzima colina acetiltransferase.
A seção é pré-tratada para desativar a peroxidase endógena.
Adicione um detergente para permeabilizar as membranas celulares, seguido por uma solução de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.
Substitua a solução por anticorpos primários que se ligam à colina acetiltransferase.
Lave com tampão para remover anticorpos não ligados. Incube com anticorpos secundários marcados com biotina, que se ligam aos anticorpos primários.
Remova os anticorpos não ligados e adicione complexos avidina-biotina-peroxidase, que se ligam aos anticorpos secundários.
Lave para remover o excesso de complexos.
Adicione um substrato cromogênico que reage com a peroxidase, formando um precipitado colorido.
Enxágüe com água destilada para remover o excesso de precipitado.
Transfira a seção para uma lâmina gelatinizada.
Em seguida, desidrate a seção usando concentrações crescentes de etanol, seguidas de xileno.
Monte a seção e observe ao microscópio para visualizar as fibras nervosas coradas.
Para marcação imuno-histoquímica das seções de tecido, após bloquear qualquer ligação inespecífica com soro bovino normal a 10% em Triton X-100 a 0,1%, em solução salina tamponada com tris, rotule as seções com o anticorpo primário de interesse, por 48 horas a quatro graus Celsius.
No final da incubação, lavar as secções três vezes, durante três minutos, em solução salina fresca tamponada com tris por lavagem. Seguida de incubação com um anticorpo secundário biotinilado adequado, durante uma hora à temperatura ambiente.
No final da incubação, lave as seções três vezes em solução salina fresca tamponada com tris, conforme demonstrado. Seguido de coloração com complexo avidina-biotina-peroxidase e solução de substrato DAB peroxidase, de acordo com os protocolos do fabricante.
Após a lavagem, monte todas as seções de uma amostra de tecido cerebral em uma lâmina gelatinizada. Deixe as amostras secarem ao ar. Para desidratar as secções, mergulhar as amostras duas vezes, durante cinco minutos por diluição, em soluções sequenciais ascendentes de etanol, conforme indicado, seguidas de limpeza com duas lavagens de xileno de 10 minutos. Em seguida, use um meio de montagem apropriado para colocar lamínulas nas lâminas.