Medindo a captação de dopamina em sinaptossomos cerebrais de camundongos usando dopamina radiomarcada

Colha sinaptossomos, estruturas ligadas à membrana derivadas dos terminais pré-sinápticos intactos das sinapses neuronais que contêm transportadores de dopamina (DAT), de um cérebro de camundongo.

Encha os tubos de ensaio com tampão contendo ligantes e os tubos de referência com tampão contendo ligantes e um inibidor de DAT.

Adicione os sinaptossomos.

Os ligantes inibem enzimas degradadoras de dopamina e outros transportadores, impedindo a degradação da dopamina e a captação inespecífica.

Introduza dopamina não marcada e radiomarcada.

Na condição de teste, o DAT sinaptossômico absorve a dopamina.

Na condição de referência, o inibidor impede a captação de dopamina mediada por DAT, permitindo apenas a captação de fundo.

Adicione as amostras a filtros de microfibra que retêm os sinaptossomos.

Lave para remover a dopamina não ligada.

Transfira os filtros para tubos de cintilação.

Adicionar líquido de cintilação contendo um composto radiossensível.

Coloque os tubos em um contador de cintilação.

As emissões radioativas da dopamina excitam o composto a emitir luz, que é medida pelo contador.

Subtraia a referência dos dados do teste para medir a captação de dopamina sinaptossômica.

Nesta etapa, adicione 440 microlitros de tampão de absorção, ligante e cocaína a 12 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro designados e 440 microlitros de tampão de absorção e ligante aos 36 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro restantes. Rotule 6 tubos de microcentrífuga de 2 mililitros como 10, 5, 2.5, 1.25, 0.62 e 0.31. Em seguida, adicione 750 microlitros de tampão de absorção e ligante aos 5 tubos de microcentrífuga com o menor número.

Em seguida, adicione 1.455,4 microlitros de tampão de captação e ligante, 14,6 microlitros de dopamina não marcada e 30 microlitros de dopamina tritiada ao tubo rotulado como 10. Em seguida, transfira 750 microlitros da mistura do tubo identificado como 10 para o tubo identificado como 5. Misture bem e transfira 750 microlitros da mistura deste tubo para o tubo rotulado como 2,5. Repita esta diluição com os tubos restantes.

Depois disso, pré-enxágue os filtros de microfibra de vidro com 4 mililitros de tampão de absorção após colocá-los em um balde de filtro de 12 poços. Em seguida, adicione 10 microlitros da suspensão de membrana sinaptossomal aos primeiros 24 tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro contendo 440 microlitros de tampão. Vórtice com cuidado e gire para baixo brevemente para garantir que os sinaptossomos estejam submersos no tampão.

Em seguida, deixe-os a 37 graus Celsius por 10 minutos. Após 10 minutos, adicione 50 microlitros de dopamina de 10 micromolares e 5 micromolares às 2 primeiras colunas e deixe-as a 37 graus Celsius por 5 minutos agitando. Após 5 minutos, pare a reação adicionando 1 mililitro de tampão de absorção gelada. Repita com 2,5 micromolares e 1,25 micromolares e, em seguida, com 0,62 micromolar e 0,31 micromolar.

Adicione as amostras aos filtros de microfibra pré-enxaguados e lave-as com 5 x 4 mililitros de tampão de absorção gelada. Depois que as primeiras 12 amostras forem adicionadas aos filtros, mova os filtros para os tubos de cintilação. Repita isso com as próximas 12 amostras. Prepare 3 tubos de contagem máxima colocando um filtro de microfibra no fundo dos tubos de cintilação 49 a 51 e adicionando 25 microlitros da dopamina máxima de 10 micromolares por cima.

Em seguida, deixar os 51 tubos de cintilação numa hotte durante 1 hora. Em seguida, adicione 3 mililitros de fluido de cintilação a cada tubo de cintilação e agite vigorosamente em uma coqueteleira por 1 hora. Para contar a dopamina tritiada em um contador beta por 1 minuto, abra o programa e escolha as configurações adequadas. Para determinação de proteínas, use um kit de ensaio de proteína BCA padrão para determinar as concentrações de proteínas dos sinaptossomos para ajustes e para comparação adequada da absorção entre as amostras.