Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
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Pegue fatias fixas e permeabilizadas de hipocampo de rato contendo interneurônios cheios de biocitina com peroxidases endógenas inativadas.
Adicione complexos avidina-biotina (ABC) contendo peroxidase de rábano (HRP) e incube, permitindo que a avidina se ligue à biocitina.
Lave o ABC não encadernado.
Adicione uma mistura de substrato cromogênico e intensificador de metal e incube.
Introduza peróxido de hidrogênio para ativar o HRP, que oxida o substrato para formar um precipitado escuro, enquanto o intensificador melhora o contraste.
Transfira as fatias para papel de filtro e remova o excesso de buffer. Trate com tetróxido de ósmio para aumentar o contraste.
Coloque as fatias em uma lâmina e monte. Desidrate-os usando concentrações crescentes de etanol.
Lave as fatias em etanol absoluto e óxido de propileno.
Adicione resina para infiltrar os tecidos.
Coloque as fatias em uma prancheta e aqueça para polimerizar a resina. Transfira as fatias para uma lâmina, coloque uma lamínula e solidifique a resina.
Usando microscopia de luz, visualize os interneurônios cheios de biocitina com coloração escura.
Coloque as secções num frasco de vidro limpo contendo PBS. Realize a reação de AVIDINA HRP incubando primeiro as seções no complexo de avidina biotina, ou ABC, por pelo menos duas horas para amplificar o produto da reação de HRP.
Em seguida, lave as seções com PBS 3 vezes por 10 minutos e, em seguida, com tampão Tris duas vezes por 10 minutos. Depois de remover a última lavagem de tampão de traço, adicione rapidamente 1 gota de solução de cloreto de níquel a 8% à solução de diaminobenzidina ou solução DAB. Em seguida, pipete a solução para dentro e para fora para misturar.
E adicione rapidamente 1 mililitro desta solução sobre as seções. Incube as seções nesta solução por 15 minutos. Em seguida, adicione 10 microlitros de peróxido de hidrogênio a 1% à solução DAB. Deixe a reação prosseguir no escuro sob agitação constante por cerca de 1 a 2 minutos, até que as células sejam marcadas.
Em uma capela, coloque um pequeno círculo de papel de filtro em uma placa de Petri e umedeça-o com PB. Levante as secções uma de cada vez do frasco de vidro com um pincel e coloque-as cuidadosamente sobre o papel. Cubra as seções com outro círculo umedecido de papel de filtro. E remova o excesso de tampão tocando suavemente o lenço de papel na superfície.
Aplique 8 ou 9 gotas de tetróxido de ósmio a 1% em PB no papel superior. Cobrir a cápsula e mantê-la na hotte durante, pelo menos, 30 minutos, mas não mais de uma hora. Após enxaguar, montar e cobrir as seções, desidrate por meio de uma série de soluções de 50%, 70%, 95% e 100% de álcool.
Após a etapa de desidratação, transfira as seções para um frasco de vidro contendo 100% de etanol em um agitador por aproximadamente 5 minutos. Substitua a solução alcoólica por óxido de propileno e lave três vezes por 5 minutos. Após a última lavagem, mantenha cerca de 2 mililitros de óxido de propileno no frasco e adicione resina na proporção de um para um.
Certifique-se de que a resina esteja dissolvida e mantenha as seções sob agitação constante por 30 minutos. Após 30 minutos, use uma vara de madeira para colocar cada seção em uma prancheta de alumínio contendo resina epóxi e incube durante a noite. No dia seguinte, coloque a prancheta em uma chapa quente por aproximadamente 10 minutos.
Em seguida, pegue cada seção com uma vara de madeira e coloque em uma lâmina limpa. Depois que todas as seções forem transferidas para a lâmina, visualize a lâmina sob um microscópio de dissecação para verificar a orientação das fatias e coloque uma lamínula sobre as seções. Catalise no forno por 48 horas a 56 graus Celsius.