Hibridização in situ usando sondas de oligonucleotídeos para estudar a expressão de RNA em seções cerebrais de ratos

Pegue seções cerebrais fixas de um rato com síndrome da serotonina, o que leva à síntese alterada de RNA do receptor de serotonina nos neurônios.

Desidrate o tecido com álcool. Aplicar uma solução de pré-tratamento para desativar as enzimas hidrolisantes endógenas, evitando a sua interação com os reagentes de deteção.

Trate com um tampão de ebulição para quebrar as ligações cruzadas induzidas pela fixação, expondo os RNAs alvo.

Desidrate o tecido, desenhe uma barreira hidrofóbica e incube-o com uma solução para permeabilizar as membranas celulares.

Adicione sondas de oligonucleotídeos e incuba, permitindo que as sondas hibridizem com os RNAs alvo.

Lave para remover as sondas não ligadas e, em seguida, incube com reagentes de amplificação contendo pré-amplificador, amplificador e sondas de marcação conjugadas com enzimas que se ligam às sondas de oligonucleotídeos.

Incubar com substratos cromogênicos que são hidrolisados pelas sondas conjugadas com enzimas, produzindo cor visível.

Trate com xileno para aumentar a transparência do tecido, adicione um meio de montagem e aplique uma lamínula.

Sob um microscópio, manchas coloridas no tecido ajudam a quantificar a expressão do RNA alvo.