Hibridização in situ usando sondas de oligonucleotídeos para estudar a expressão de RNA em seções cerebrais de ratos

Pegue seções cerebrais fixas de um rato com síndrome da serotonina, o que leva à síntese alterada de RNA do receptor de serotonina nos neurônios.

Desidrate o tecido com álcool. Aplicar uma solução de pré-tratamento para desativar as enzimas hidrolisantes endógenas, evitando a sua interação com os reagentes de deteção.

Trate com um tampão de ebulição para quebrar as ligações cruzadas induzidas pela fixação, expondo os RNAs alvo.

Desidrate o tecido, desenhe uma barreira hidrofóbica e incube-o com uma solução para permeabilizar as membranas celulares.

Adicione sondas de oligonucleotídeos e incuba, permitindo que as sondas hibridizem com os RNAs alvo.

Lave para remover as sondas não ligadas e, em seguida, incube com reagentes de amplificação contendo pré-amplificador, amplificador e sondas de marcação conjugadas com enzimas que se ligam às sondas de oligonucleotídeos.

Incubar com substratos cromogênicos que são hidrolisados pelas sondas conjugadas com enzimas, produzindo cor visível.

Trate com xileno para aumentar a transparência do tecido, adicione um meio de montagem e aplique uma lamínula.

Sob um microscópio, manchas coloridas no tecido ajudam a quantificar a expressão do RNA alvo.

Neste procedimento, para desidratação, pegue quatro lâminas para caixas de lâminas de microscópio armazenadas no freezer negativo de 80 graus Celsius. Atribua as seções aos testes dos genes ppiB, dapB e ht2a. Marque-os e etiquete-os com uma caneta esferográfica.

Em seguida, mergulhe as lâminas em álcool 100% em temperatura ambiente por cinco minutos. Em seguida, secar as lâminas durante cinco minutos na hotte. Para o pré-tratamento, pipetar 20 microlitros do pré-tratamento de um reagente para cada seção.

Coloque as corrediças em um trilho de rack em uma bandeja de umidade. Agite suavemente a bandeja de umidade em um agitador horizontal em velocidade baixa por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por dois minutos. Mergulhe as lâminas em um béquer de 1.000 mililitros contendo 450 mililitros do reagente de pré-tratamento 2.

Em seguida, ferva as lâminas por um total de cinco minutos a 100 graus Celsius para restaurar a estrutura do RNA. Depois disso, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por dois minutos de cada vez. Coloque as lâminas em álcool 100% por cinco minutos.

Em seguida, secar as lâminas durante cinco minutos na hotte. Use uma caneta hidrofóbica para desenhar um círculo ao redor da área selecionada na seção de tecido. Em seguida, pipete 10 microlitros do reagente de pré-tratamento para cada área selecionada para aumentar a penetração da sonda e cubra a bandeja de umidade com uma tampa.

Em seguida, coloque a bandeja no forno de hibridização equipado com uma coqueteleira horizontal. Defina a temperatura do forno para 40 graus Celsius e agite suavemente a bandeja por 30 minutos. Depois, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por dois minutos de cada vez.

Nesta etapa, pipete 10 microlitros de sonda ppiB, dapB ou htr2a nas áreas selecionadas. Em seguida, cubra a bandeja de umidade com uma tampa para evitar a evaporação do reagente. Agite suavemente as lâminas do shaker horizontal em baixa velocidade enquanto as incuba a 40 graus Celsius no forno por duas horas.

Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos de cada vez. Pipetar 10 microlitros do reagente de amplificação 1 em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos de cada vez.

Pipetar 10 microlitros do reagente de amplificação 2 em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos. Depois disso, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos de cada vez.

Pipetar 10 microlitros do reagente de amplificação 3 em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 30 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos.

Pipete 10 microlitros do reagente de amplificação 4 em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas a 40 graus Celsius por 15 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos.

Pipete 10 microlitros do reagente de amplificação 5 em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos.

Pipetar 10 microlitros do reagente de amplificação 6 em cada área selecionada. Agite e incube as lâminas em temperatura ambiente por 15 minutos. Em seguida, lave as lâminas novamente duas vezes com tampão de lavagem por dois minutos de cada vez.

Agora, pipete 10 microlitros do reagente vermelho para cada área selecionada. Coloque as lâminas na bandeja de umidade no agitador horizontal em temperatura ambiente e agite suavemente em velocidade baixa por 10 minutos. Em seguida, lave as lâminas duas vezes com água bidestilada por 10 minutos de cada vez.

Seque as lâminas a 60 graus Celsius no forno por 15 minutos. Em seguida, colocar as lâminas em xileno na hotte durante cinco minutos. Em seguida, pipete 20 microlitros de mídia de montagem à base de xileno em cada área selecionada e cubra com uma lamínula.