Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:26 min. • July 8th, 2025
Comece com cérebros de moscas transgênicas Drosophila, contendo diferentes tipos de células gliais que abrigam um sistema de recombinase específico da célula.
Ele impulsiona a expressão de uma proteína de superfície celular fundida a diferentes epítopos antigênicos no mesmo tipo de células.
Trate o tecido com um fixador para reticular proteínas e preservar a arquitetura do tecido.
Lave para remover o excesso de fixador.
Adicione proteínas bloqueadoras para mascarar locais de ligação não específicos para reduzir a coloração de fundo.
Incube o tecido com um coquetel de anticorpos primários que se liga aos diferentes epítopos expressos nas células gliais.
Lave para remover anticorpos primários não ligados.
Incubar com anticorpos secundários conjugados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.
Lave para remover anticorpos secundários não ligados.
Monte o cérebro dentro de um espaçador de imagem e coloque uma lamínula. O espaçador cria uma câmara para o tecido, preservando sua estrutura tridimensional.
Diferentes células do mesmo tipo glial marcadas com diferentes anticorpos conjugados com fluoróforo permitem uma compreensão das interações célula-célula.
Transfira os cérebros isolados usando uma ponta de pipeta P10 para um tubo de microcentrífuga de 200 microlitros com solução fixadora. Nunca manuseie o cérebro usando fórceps. Incube os tecidos protegidos da luz. Evite aspirar o cérebro durante as transferências de solução.
Para remover o fixador, use três ou mais lavagens de 15 minutos com solução de lavagem. Em seguida, bloqueie os tecidos com solução de bloqueio por 30 minutos ou mais. Em seguida, substitua a solução de bloqueio por anticorpos primários diluídos em solução de lavagem e incube os cérebros durante a noite a 4 graus Celsius.
Para remover os anticorpos primários, use três lavagens de 1 hora na solução de lavagem. Em seguida, adicione anticorpos conjugados com fluoróforo secundário na solução de lavagem e incube os cérebros durante a noite a 4 graus Celsius ou por 4 horas em temperatura ambiente. Para lavar completamente os anticorpos não ligados, use três lavagens de 1 hora em solução de lavagem, seguidas de uma lavagem mais longa com PBS.
Em seguida, monte os cérebros. Prepare duas lamínulas com um espaçador de imagem. No espaçador, e na lamínula extra, aplique 10 microlitros de meio de montagem com um agente anti-desbotamento. Em seguida, usando uma pipeta P10, transfira os cérebros para a lamínula, depositando-os ao lado do meio junto com um pouco de PBS. Não deixe o tecido secar.
Agora, mova cuidadosamente os cérebros para o meio de montagem, usando a pipeta. E, finalmente, mova-os para o meio no espaçador e arrume-os com uma pinça. Em seguida, remova o revestimento adesivo dos espaçadores e coloque uma lamínula. Prenda a lamínula com um pouco de pressão usando uma pinça e prossiga imediatamente com a imagem.