Coloração de fluorescência de células da crista neural cultivadas em hidrogéis de rigidez variável

Pegue culturas de células da crista neural aderentes cultivadas em lamínulas revestidas com hidrogéis de rigidez variável. Lave as células com tampão.

Adicione paraformaldeído para fixar as células e preservar a morfologia celular.

Lave as células com tampão para remover qualquer excesso de paraformaldeído.

Em seguida, adicione um detergente não iônico para permeabilizar as membranas celulares.

Lave as células com tampão para remover o excesso de detergente.

Em seguida, introduza uma solução de bloqueio para evitar a ligação não específica.

Incube as células com uma sonda de actina filamentosa de alta afinidade que se liga aos filamentos de actina.

Lave as células com tampão para remover quaisquer sondas não ligadas.

Adicione um corante nuclear fluorescente para manchar os núcleos e, em seguida, lave com tampão para remover o excesso de corante.

Aplique o meio de montagem nas lamínulas e examine as células coradas sob um microscópio de fluorescência.

As células cultivadas em hidrogéis mais rígidos mostram maior formação de filamentos de actina e uma morfologia mais espalhada do que aquelas cultivadas em hidrogéis mais macios.

Use uma pinça para transportar as lamínulas para uma nova placa para minimizar os sinais falsos das células cultivadas diretamente na placa. Em seguida, fixe as células usando 500 microlitros de paraformaldeído a 4% por 10 minutos, antes de tratar as células com 500 microlitros de Triton X-100 a 0,1% em temperatura ambiente.

Após 15 minutos, bloqueie as células com 250 microlitros de soro Donkey a 10%. Corar as células para F-actina com faloidina em uma diluição de 1 a 400 em 250 microlitros de soro Donkey a 10%, seguido de incubação com DAPI por 10 minutos.

Lave as células com PBS por dois minutos antes de adicionar três a quatro gotas de meio de montagem em cada poço. Em um microscópio de fluorescência, capture as imagens de pelo menos três quadros aleatórios por amostra de hidrogel, produzindo canais individuais e mesclados.