Reticulação de proteínas de superfície neuronal no cérebro de camundongos usando um ensaio de reticulação química

Comece com um cérebro de camundongo isolado em um tampão gelado.

Transfira o cérebro para uma matriz cerebral, com o lado ventral voltado para cima.

Insira lâminas de barbear para cortar em série a parte anterior do cérebro.

Levante as fatias segurando as lâminas juntas, deixando a parte posterior para trás. Separe as lâminas de barbear e coloque-as em uma superfície gelada com fatias de cérebro voltadas para cima.

Selecione a fatia desejada e extraia a região de interesse.

Divida e pique o tecido.

Transfira o tecido picado para um tubo contendo líquido cefalorraquidiano suplementado com o produto químico BS3.

Inverta e misture o tubo para quebrar o tecido em pedaços menores e, em seguida, incube com rotação.

O BS3, um produto químico impermeável à membrana celular, reticula proteínas de superfície neuronal como os receptores GABA, enquanto os receptores internos de GABA permanecem inalterados.

Adicione glicina para extinguir a reação de reticulação.

A amostra está pronta para avaliação dos níveis de receptores GABA de superfície.

Para começar, remova rapidamente o cérebro do crânio do camundongo C57 preto 6J sacrificado. Mergulhe-o em uma placa de Petri contendo PBS gelado por 10 a 15 segundos. Coloque o cérebro resfriado na matriz cerebral no gelo voltado para o lado ventral para cima. Para cortar o cérebro coronalmente, insira a primeira lâmina de barbear na borda entre o bulbo olfatório e o pedúnculo olfatório. Usando três a quatro lâminas de barbear adicionais, corte em série a parte anterior do cérebro em intervalos de 1 milímetro.

Segure as lâminas de barbear inseridas juntas para levantar as fatias coronais da matriz cerebral, deixando a parte posterior para trás. Usando uma pinça, separe as lâminas de barbear umas das outras e coloque-as na superfície plana e gelada com a fatia do cérebro voltada para cima.

Para amostrar o córtex pré-frontal, escolha a segunda e a terceira fatias posteriores à primeira fatia contendo o pedúnculo olfatório. Usando um punção de tecido ou fórceps, remova a região desejada. Coloque o lenço na lâmina de barbear gelada e divida-o uniformemente em dois pedaços. Use a ponta fina da pinça para picar cada tecido em pedaços na lâmina de barbear com vários movimentos verticais. Crave o tubo rotulado pré-resfriado contendo líquido cefalorraquidiano artificial com 30 microlitros de solução BS3. Em seguida, transfira imediatamente os tecidos picados para o tubo desejado.

Para reação de reticulação, inverta o tubo contendo tecido e solução para quebrar os pedaços de tecido em pequenos pedaços. Incube as amostras no rotador do tubo a 4 graus Celsius por 30 minutos a 2 horas e registre a hora de início da incubação BS3 para cada tubo. Em seguida, extinguir a reação com 78 microlitros de glicina 1 molar. Incube ainda mais por 10 minutos a 4 graus Celsius com rotação constante e registre a hora de início e término da têmpera.