Avaliação da captação de glicose nos neurônios motores de larvas de Drosophila com metabolismo de glicose regulado positivamente

Coloque as larvas de controle e mutantes de Drosophila em pratos separados contendo um tampão livre de glicose.

Disseque as larvas para remover órgãos internos, expondo o sistema nervoso central ou o SNC.

O SNC inclui um cordão nervoso ventral que abriga neurônios motores. Nas larvas mutantes, esses neurônios exibem metabolismo da glicose regulado positivamente.

Os neurônios motores em ambos os grupos expressam sensores intracelulares de glicose contendo fluoróforos doadores e aceptores.

Posicione as larvas sob um microscópio confocal. Após a excitação, o fluoróforo do doador emite fluorescência.

Localize os neurônios motores usando esta fluorescência.

Substitua o tampão por uma solução suplementada com glicose.

A glicose entra nos neurônios, ligando-se aos sensores e desencadeando uma mudança conformacional que aproxima os dois fluoróforos.

Após a excitação, o aceptor absorve a energia emitida pelo doador, denominada transferência de energia de ressonância de fluorescência ou FRET, e emite fluorescência.

O sinal FRET se correlaciona com a captação de glicose. Uma maior intensidade de sinal aceptor nas larvas mutantes em comparação com o controle indica metabolismo da glicose regulado positivamente.

Antes de iniciar as dissecções, ligue o microscópio de imagem e os lasers. Em seguida, colete uma larva de terceiro ínstar errante. Enxágue com água bidestilada e coloque-o em uma gota de tampão HL3 em um prato forrado com elastômero previamente preparado.

Em seguida, sob um microscópio de dissecação, use um par de pinças para prender as extremidades anterior e posterior da larva, com o lado dorsal para cima, esticando cuidadosamente a larva longitudinalmente com alfinetes de insetos. Usando uma tesoura de íris angular, faça uma incisão logo acima do pino posterior. Em seguida, faça um corte vertical da incisão em direção à extremidade anterior da larva.

Depois de adicionar algumas gotas de tampão HL3, se necessário, remova a traqueia e o resto dos órgãos flutuantes sem perturbar o sistema nervoso central. Em seguida, prenda os retalhos, esticando a parede do corpo, para expor o sistema nervoso central, mantendo o sistema neuromuscular intacto.

Para aquisição de imagens, use um microscópio confocal vertical com uma lente de imersão em água 40 vezes. Em seguida, selecione o laser de 405 nanômetros para excitar o CFP. Em seguida, otimize os parâmetros de aquisição, como velocidade de varredura, média, objetivo, tamanho do orifício de zoom e resolução espacial. Ajuste o ganho de forma que o sinal esteja na faixa dinâmica ideal e use os mesmos parâmetros para todos os genótipos.

Para obter imagens dos neurônios motores dentro do cordão nervoso ventral, coloque a placa de silicone com a amostra dissecada sob a lente e abaixe a lente para que ela entre em contato com a trealose sacarose HL3. Certifique-se de que a lente esteja completamente submersa no buffer e adicione mais buffer, se necessário.

Em seguida, usando os canais CFP e FRET, selecione manualmente uma seleção óptica que consiste em pelo menos 6 neurônios motores em foco, localizados ao longo da linha média do cordão nervoso ventral. Em seguida, adquira imagens a cada 10 segundos ou 10 minutos. Essas imagens representam a linha de base.

Para estimulação de glicose, remova a trealose sacarose contendo tampão HL3 usando uma pipeta Pasteur e adicione tampão HL3 suplementado com glicose 5 milimolares sem mover o cordão nervoso ventral. Em seguida, adquira imagens a cada 10 segundos por mais 10 minutos.

Essas imagens representam a fase de estimulação. Salve as imagens como arquivos dot czi ou qualquer tipo de arquivo suportado pelo software de imagem com um nome de arquivo que inclua data, histórico genético, condição experimental e canais usados. Reutilizou os parâmetros para criar imagens de todos os genótipos.