Imunocoloração de astrócitos marcados com fluorescência em uma seção de tecido cerebral de camundongo

Pegue uma seção fixa de tecido cerebral de camundongo contendo uma população esparsa de astrócitos expressando uma proteína fluorescente.

Trate a seção flutuante com um tampão contendo detergente para permeabilizar as células.

Incube a seção em um tampão de bloqueio para evitar a ligação de anticorpos não específicos.

Trate a seção com anticorpos primários e incube para permitir que os anticorpos se liguem às proteínas fluorescentes nos astrócitos.

Lave qualquer excesso de anticorpos primários usando tampão.

Em seguida, incube a seção com anticorpos secundários marcados com fluoróforo que se ligam aos anticorpos primários.

Lave os anticorpos secundários não ligados com um tampão.

Transfira a seção para uma mistura de água deionizada tampão para remover resíduos de detergente.

Coloque a seção em uma lâmina contendo água deionizada com tampão. Remova o excesso de líquido e adicione o meio de montagem. Em seguida, posicione uma lamínula e prenda-a.

Finalmente, use microscopia confocal para visualizar os astrócitos que expressam proteínas fluorescentes marcados dentro da seção.

Para começar, prepare uma nova solução de TBST adicionando 1 mililitro de Triton X a 10% a um tubo de 50 mililitros e enchendo o tubo a 50 mililitros com TBS. Prepare 2 mililitros de soluções de bloqueio e anticorpos para cada cérebro combinando soro de cabra e TBST em um tubo de 15 mililitros.

Em seguida, rotule uma placa de 24 poços para colocar amostras diferentes em linhas diferentes, em soluções diferentes, em colunas diferentes. Em seguida, adicione 1 mililitro de TBST às três primeiras colunas rotuladas como 'Lavagem 1', 'Lavagem 2' e 'Lavagem 3' e adicione 1 mililitro de solução de bloqueio à quarta coluna.

Prepare uma palheta de vidro derretendo a ponta de uma pipeta Pasteur de 5.75 polegadas em um pequeno gancho usando um bico de Bunsen. Em seguida, transfira as seções de tecido da placa de 12 poços para a coluna 'Wash 1' da placa de 24 poços usando o pick. Em seguida, lave as seções por 10 minutos cada em Wash 1, 2 e 3 poços usando o palito de vidro para transferir as seções de um poço para o outro, seguido de incubação das seções por uma hora na solução de bloqueio.

Em seguida, incube as seções no anticorpo primário por duas a três noites a 4 graus Celsius enquanto agita. Após a incubação primária de anticorpos, aspire o TBST do primeiro dia dos poços de lavagem. Em seguida, adicione 1 mililitro de novo TBST a cada poço de lavagem e mova as seções para o primeiro poço de lavagem.

Em seguida, incube seções em anticorpo secundário por três horas em temperatura ambiente. Após a incubação secundária de anticorpos, aspire o TBST do segundo dia dos poços de lavagem. Em seguida, adicione 1 mililitro de novo TBST a cada poço de lavagem e mova as seções para o primeiro poço de lavagem.

Durante a lavagem final, retire a mídia de montagem de 4 graus Celsius e deixe-a aquecer até a temperatura ambiente. Em seguida, prepare uma mistura de 2 para 1 de TBS em água deionizada e adicione-a a uma placa de Petri. Em seguida, prepare uma lâmina de microscópio adicionando 800 microlitros de mistura 2 para 1 de TBS em água deionizada à superfície.

Transfira as seções do poço 'Wash 3' para a placa de Petri. Em seguida, usando um pincel fino, transfira as seções uma de cada vez da placa de Petri para o líquido na lâmina. Em seguida, organize cuidadosamente as seções para que fiquem planas no slide usando o pincel. Remova cuidadosamente o excesso de líquido da lâmina com uma pipeta P1000, seguida de aspiração a vácuo.

Depois que todo o excesso de líquido for removido da lâmina, use uma pipeta de transferência para adicionar imediatamente uma gota de mídia de montagem a cada seção e coloque suavemente uma lamínula sobre a lâmina. Deixe a mídia de montagem se espalhar por alguns minutos e, em seguida, remova qualquer excesso de mídia de montagem que saia de baixo da lamínula por aspiração a vácuo. Depois, sele todas as quatro bordas da lamínula com esmalte transparente.