Microdissecção por captura a laser para isolar células de Purkinje de um tecido humano post-mortem do cerebelo

Pegue um tecido cerebelar humano post-mortem contendo as camadas de células de Purkinje, grânulos e células moleculares.

Coloque-o em um suporte de amostra de criostato contendo mídia de incorporação parcialmente congelada.

Deixe a mídia congelar completamente, prendendo o tecido.

Transfira este conjunto para o braço de corte do criostato e permita que o tecido se acostume à temperatura do criostato.

Aproxime o tecido da lâmina e corte-o para expor as camadas do córtex.

Coloque uma placa estabilizadora acima da lâmina e obtenha seções cerebelares.

Transfira essas seções para uma lâmina de membrana.

Incubar em concentrações crescentes de etanol para fixação e desidratação tecidual.

Em seguida, incube em xileno.

Seque a lâmina e coloque-a em um microscópio de captura a laser UV stage.

Posicione a tampa de coleta sobre o tecido cerebelar.

Microscopicamente, concentre-se nas células de Purkinje.

Usando o laser, capture e colete as células de Purkinje para análise posterior.

Primeiro, corte um pequeno pedaço de tecido para seccionar, certificando-se de que a seção tenha aproximadamente 95% do córtex cerebelar. Retorne o tecido restante para gelo seco ou para um freezer a 80 graus Celsius negativos. Em seguida, comece a adicionar lentamente OCT na parte superior do mandril com um movimento circular lento. Construa camadas de OCT até que haja um monte de aproximadamente três milímetros de altura cobrindo o mandril.

Quando a OCT estiver parcialmente congelada, mas ainda tiver algum líquido no centro, coloque os lenços em cima do monte. Deixe os lenços de papel em cima da OCT por 1 a 2 minutos até que esteja completamente congelada. Em seguida, transferir o mandril com a OCT congelada e o tecido para o braço de corte do criostato. Ajuste o tecido para que fique nivelado com a lâmina de corte e deixe os tecidos descansarem no braço de corte por 20 minutos para se ajustar à nova temperatura.

A etapa mais crítica é permitir que o tecido se aclimate no braço de corte do criostato pelo tempo que for necessário. Se o tecido se fragmentar, a visualização das células de Purkinje será muito difícil. Eu recomendo usar pedaços de tecido menores e mais finos para permitir que o tecido se acostume mais rapidamente.

Depois disso, mova lentamente o tecido para mais perto da lâmina. Assim que o tecido atingir a lâmina, inicie o processo de corte. Apare o tecido 2 a 3 vezes até que as camadas do córtex fiquem visíveis.

Em seguida, coloque e alinhe a placa anti-rolamento logo acima da lâmina do criostato. Corte de 4 a 6 seções com 14 micrômetros de espessura, observando que as seções cortadas corretamente serão planas sob a placa estabilizadora. Alinhe as seções cortadas horizontalmente ao longo do estágio de criostato.

Incline um slide para pegar todos os pedaços de tecido simultaneamente. Imediatamente após seccionar o tecido, coloque a lâmina em um suporte de lâmina com etanol a 70% no gelo por 2 minutos. Transfira a lâmina para um suporte de lâmina com etanol 95% no gelo por 45 segundos.

Em seguida, coloque a lâmina em um suporte de lâmina com etanol 100% em temperatura ambiente por 2 minutos. Mergulhe a lâmina 3 vezes no suporte da lâmina contendo xileno número 1 à temperatura ambiente. Em seguida, coloque a lâmina em um suporte de lâmina com xileno 2 em temperatura ambiente por 5 minutos. Coloque as corrediças em um exaustor limpo e deixe-as secar ao ar por pelo menos 30 minutos.

Primeiro, use RNase descontaminada para limpar o microscópio stage no braço de coleta da tampa. Com as mãos enluvadas, coloque a lâmina no microscópio e uma tampa opaca de 500 microlitros no braço de coleta. Em uma ampliação baixa, alinhe a tampa opaca sobre o tecido cerebelar, garantindo que a tampa cubra toda a área visualizada na ocular.

Use uma objetiva de 5 a 10 vezes para visualizar as camadas cerebelares. Coloque o cursor sobre a seção onde a camada molecular e a camada de células granulares se cruzam. Mova-se para uma ampliação de 40 vezes e visualize as células de Purkinje. Em seguida, comece a capturá-los.