Processamento de um cérebro de camundongo para análise a jusante

Pegue um cérebro de camundongo recém-colhido e congele-o rapidamente em isopentano pré-resfriado para rápida preservação do tecido.

Em seguida, transfira o cérebro, com o córtex voltado para cima, para uma matriz cerebral congelada para manter um ambiente frio durante o corte.

Permita que o cérebro se equilibre com a temperatura da matriz. Alinhe-o na matriz ao longo dos seios sagital e transverso para garantir seções simétricas.

Insira lâminas geladas no cérebro, garantindo o alinhamento adequado.

Em seguida, pressione-os uniformemente para obter seções cerebrais uniformes.

Remova as lâminas com as seções e posicione-as, com o lado rostral para cima, sobre uma placa de vidro congelada.

Organize os cortes da orientação rostral para caudal na ordem anatômica correta. Agora, separe-os.

Usando uma referência cerebral adequada, localize e retire a região de interesse da seção.

Transferir o tecido excisado para um frasco pré-refrigerado para análise a jusante.

Depois de remover cérebros de camundongos adultos do tipo selvagem CD-1 sacrificados, congelam rapidamente o tecido por 60 segundos em nitrogênio líquido ou isopentano pré-resfriado com gelo seco e o armazenam a -80 graus Celsius.

24 horas antes de dissecar o tecido, coloque uma matriz cerebral limpa em uma pilha de freezers descongelados e coloque as laterais da matriz entre dois freezers, certificando-se de deixar aproximadamente meio centímetro entre a parte inferior das ranhuras da navalha e a parte superior dos pacotes.

Configure uma placa de vidro congelada para a dissecação, enchendo uma caixa isolada com gelo até aproximadamente 5 centímetros do topo. Em seguida, coloque uma camada de gelo seco de 2,5 centímetros por cima e cubra-a com uma folha de plástico preta. Coloque uma placa de vidro em cima do plástico e gelo seco ao redor das bordas da placa.

Remova a matriz cerebral congelada do freezer e insira o lado do córtex cerebral para cima na matriz. Deixe o tecido se equilibrar à temperatura na caixa por 10 minutos, mantendo a tampa aberta durante esse tempo. Use uma pinça fria para ajustar a posição do cérebro na matriz, de modo que o seio sagital e o seio transverso se alinhem com os sulcos perpendiculares do bloco.

Quando o cérebro estiver em posição, coloque uma lâmina de barbear gelada perto de seu centro e pressione-a aproximadamente 1 milímetro no tecido. Em seguida, coloque uma lâmina gelada em cada extremidade do cérebro e pressione totalmente para baixo na matriz. Em seguida, comece a adicionar lâminas resfriadas na extremidade rostral, colocando-as nas ranhuras, uma de cada vez, e pressionando-as suavemente 1 milímetro no tecido. Continue a adicionar lâminas em intervalos de 1 milímetro, trabalhando em direção à extremidade caudal.

Quando todas as lâminas estiverem no lugar, pressione a parte superior com os dedos, a palma da mão ou um objeto pontiagudo e balance-as lentamente de um lado para o outro para movê-las pelo tecido. Assim que as lâminas atingirem o fundo das ranhuras, segure cada lado do grupo de lâminas e liberte-as da matriz balançando para frente e para trás.

Depois de liberar o grupo de lâminas, coloque-as com o lado rostral voltado para cima na placa de vidro e coloque gelo seco ao lado ou em cima da pilha para congelar ainda mais as amostras para facilitar a separação. Em seguida, coloque a pilha com as bordas afiadas para baixo e separe as lâminas deslocando a pilha entre o polegar e os dedos.

Alinhe a seção nas placas de vidro de rostral para caudal e separe o tecido das lâminas flexionando-as entre os dedos ou separando-as com uma segunda lâmina resfriada. Às vezes, o tecido pode grudar em ambos os lados de uma lâmina e deve-se tomar cuidado para manter a orientação rostral-caudal.

Antes de iniciar a dissecação, abra o Allen Mouse Brain Atlas ou outra referência e encontre os pontos de referência necessários para identificar as regiões de interesse. Use pinças ou lâminas resfriadas para virar a seção e certifique-se de que a região de interesse seja consistente em toda a seção.

Corte a seção com um bisturi ou punção limpo, empurrando o metal suavemente, mas com firmeza, no tecido, balançando-o para frente e para trás para fazer o corte. Após a colheita da região de interesse, coloque-a em tubos pré-resfriados de 1,5 mililitro rotulados e armazene-os a -80 graus Celsius.