Obtenção de uma suspensão unicelular de tecido cerebral de rato congelado

Descongele uma seção de tecido cerebral de rato congelado.

Adicione tampão e pique o tecido. Em seguida, transfira-o para um tubo contendo tampão e misture.

Centrifugue a mistura e descarte o sobrenadante.

Adicione uma solução enzimática proteolítica ao tecido e ressuspenda-o usando uma pipeta de grande diâmetro.

Incube a mistura para quebrar a matriz extracelular, afrouxando as células neurais.

Centrifugue a mistura e descarte o sobrenadante.

Ressuspenda os fragmentos de tecido em um tampão resfriado e pipete-os repetidamente para dissociar as células.

Deixe os detritos e as células não dissociadas assentarem e, em seguida, transfira a suspensão de célula única para um novo tubo.

Transfira as células para etanol gelado e misture. Incube-os para fixar e permeabilizar as células.

Centrifugar a suspensão e rejeitar o sobrenadante.

Ressuspenda as células neurais em um tampão frio para análise posterior.

Para picar o tecido, deixe as amostras descongelarem em uma placa de vidro frio por não mais de 1 minuto antes de cobrir as amostras com uma a duas gotas de solução tampão A. Em seguida, segurando uma lâmina de barbear completamente vertical à placa, pique o tecido 100 vezes em cada direção ortogonal. Para picar completamente o tecido, é fundamental mantê-lo úmido com o tampão A e seguir os tempos e a direção de picagem especificados.

É fundamental remover a maior parte da substância branca durante a dissecção do tecido e manter o tecido coberto com tampão A, para melhorar a eficiência da picagem e manter a saúde das células.

Quando o tecido tiver sido completamente processado, use a lâmina de barbear para transferir as peças para um tubo de microcentrífuga contendo 1 mililitro de tampão frio A e inverta o tubo três a cinco vezes para submergir todo o tecido picado na solução. Para dissociar os fragmentos de tecido em uma única suspensão celular, pelete as amostras por centrifugação.

Descarte o sobrenadante e, em seguida, adicione lentamente 1 mililitro de solução enzimática fria e recém-descongelada pela parede interna do microtubo e use uma pipeta de ponta grande para aspirar e dispensar imediatamente a totalidade de cada pellet quatro vezes para dispersar os pedaços de tecido picados. Em seguida, inverta rapidamente o microtubo para evitar que os pellets grudem no fundo do tubo e incube a amostra com mistura de ponta a ponta por 30 minutos a 4 graus Celsius.

No final da digestão, centrifugue novamente o tubo e adicione 0,6 mililitros de tampão frio A às células. Usando a mesma ponta de pipeta, aspire e dispense imediatamente os pellets cinco vezes, depois selecione uma pipeta de vidro de 1,3 milímetro e use-a para titular suavemente as amostras 10 vezes.

Coloque a amostra no gelo por 2 minutos para permitir que os detritos e as células não dissociadas se depositem no fundo do tubo. Em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros. Em seguida, transfira 800 microlitros de células do primeiro tubo de sobrenadante coletado para cada um dos dois primeiros tubos de etanol.

Inverta os tubos para misturar as amostras. Em seguida, coloque as amostras no gelo por 15 minutos com mistura por inversão a cada 5 minutos. No final da incubação, centrifugue as células. Em seguida, tocando apenas a parede do microtubo, use uma micropipeta para remover lentamente todos, exceto os últimos 50 microlitros de cada sobrenadante.