Avaliando o estado de palmitoilação de proteínas da membrana celular do tecido cerebral de camundongos

Pegue proteínas da membrana celular do tecido cerebral do camundongo.

Essas proteínas exibem modificação pós-traducional com grupos palmitoil, um ácido graxo, ligado a resíduos de cisteína.

Adicione um tampão redutor e incube em alta temperatura para quebrar as ligações entre cisteínas não palmitoiladas, expondo-as.

Incubar com um reagente bloqueador que se liga às cisteínas expostas, deixando apenas as cisteínas palmitoiladas reativas.

Transfira a solução, misture com clorofórmio, metanol e água deionizada, centrifugue para precipitar as proteínas e remova quaisquer impurezas. Em seguida, adicione metanol, centrifugue e descarte todos os contaminantes restantes.

Adicione um tampão, sonicate para solubilizar o pellet, centrifugue e remova os materiais insolúveis.

Aplique um reagente de clivagem para remover os grupos palmitoila das cisteínas palmitoiladas.

Repita a precipitação de clorofórmio-metanol e remova quaisquer impurezas.

Incubar com um polímero que se liga a cisteínas desbloqueadas, ajudando a identificar as proteínas palmitoiladas.

Repita a precipitação de clorofórmio-metanol e remova quaisquer polímeros não ligados.

Ressuspenda o pellet para análise posterior do estado d