Detecção de interações proteína-proteína em larvas de Drosophila usando um ensaio de ligação de proximidade

Pegue a parede corporal das larvas de Drosophila, consistindo de músculos inervados por neurônios motores para formar junções neuromusculares ou NMJs.

A membrana muscular pós-sináptica na JNM contém proteínas ligadas à membrana que interagem, que são marcadas com anticorpos primários.

Adicione sondas de ensaio de ligação de proximidade, ou PLA, contendo anticorpos secundários conjugados a oligonucleotídeos de fita simples. Incube para que as sondas se liguem aos anticorpos primários.

Lave todas as sondas não ligadas.

Incubar com tampão de ligação contendo oligonucleotídeos conectores e enzimas ligase.

A proximidade das proteínas que interagem facilita a ligação do conector às sondas. A ligase então sela as lacunas, criando DNA circular.

Lave todos os conectores não ligados.

Incubar com uma solução de amplificação contendo polimerase, que amplifica o DNA circular por meio da amplificação do círculo rolante.

As sondas detectoras marcadas com fluoróforo na solução recoozem o DNA amplificado e, após a excitação, produzem um sinal fluorescente.

Monte a parede do corpo em uma lâmina para visualizar as interações proteína-proteína marcadas com fluorescência na JNM.

Para iniciar o ensaio, adicione uma diluição de 1 a 5 em pelo menos 200 microlitros de volume total de sonda PLA anti-mouse minus e PLA sonda anti-coelho plus em 1% BSA às paredes do corpo. Incubar por duas horas a 37 graus Celsius.

Depois de usar o tampão de lavagem A para lavar as paredes do corpo duas vezes por 5 minutos cada, adicione uma diluição de 1 a 40 de ligase em solução de ligase. Incube por uma hora a 37 graus Celsius.

Após a incubação, use o tampão de lavagem A para lavar as paredes do corpo duas vezes por 2 minutos cada antes de adicionar uma diluição de 1 a 80 da polimerase em solução de amplificação. Incubar por duas horas a 37 graus Celsius.

Para preparar as amostras para imagem, use o tampão de lavagem B para lavar as paredes do corpo duas vezes por 10 minutos cada. Em seguida, use uma diluição de 100 X do tampão de lavagem B para fazer uma lavagem final por 1 minuto. Equilibre as paredes da carroceria em algumas gotas de solução de montagem por pelo menos 30 minutos.

Usando uma pinça fina, transfira cuidadosamente as paredes do corpo para uma lâmina de plataforma com as cutículas voltadas para baixo. Posicione-os em linhas na mesma orientação dentro de uma ou duas gotas de solução de montagem. Coloque uma lamínula de 22 milímetros por 40 milímetros sobre a preparação, tomando cuidado para não gerar bolhas de ar. Em seguida, use esmalte transparente para selar o slide.