Detecção de interações proteína-proteína em larvas de Drosophila usando um ensaio de ligação de proximidade

Pegue a parede corporal das larvas de Drosophila, consistindo de músculos inervados por neurônios motores para formar junções neuromusculares ou NMJs.

A membrana muscular pós-sináptica na JNM contém proteínas ligadas à membrana que interagem, que são marcadas com anticorpos primários.

Adicione sondas de ensaio de ligação de proximidade, ou PLA, contendo anticorpos secundários conjugados a oligonucleotídeos de fita simples. Incube para que as sondas se liguem aos anticorpos primários.

Lave todas as sondas não ligadas.

Incubar com tampão de ligação contendo oligonucleotídeos conectores e enzimas ligase.

A proximidade das proteínas que interagem facilita a ligação do conector às sondas. A ligase então sela as lacunas, criando DNA circular.

Lave todos os conectores não ligados.

Incubar com uma solução de amplificação contendo polimerase, que amplifica o DNA circular por meio da amplificação do círculo rolante.

As sondas detectoras marcadas com fluoróforo na solução recoozem o DNA amplificado e, após a excitação, produzem um sinal fluorescente.

Monte a parede do corpo em uma lâmina para visualizar as interações proteína-proteína marcadas com fluorescência na JNM.

Para iniciar o ensaio,