JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 2:42 min • July 8th, 2025
Coloque as mitocôndrias isoladas das células do neuroblastoma em um tampão contendo corante fluorescente impermeável à membrana e ligante ao cálcio.
Incubar para permitir que as mitocôndrias se estabilizem no tampão.
Adicione tampão contendo cálcio e incube com agitação.
Os íons de cálcio se ligam às moléculas do corante, causando sua fluorescência.
Usando um espectrômetro de fluorescência, monitore a fluorescência do corante em tempo real.
Agora, injete tampão contendo cálcio em intervalos regulares.
O aumento da concentração de cálcio promove a absorção de cálcio mitocondrial, reduzindo os íons de cálcio livres disponíveis para se ligar ao corante, o que resulta em diminuição da fluorescência.
Uma vez que as mitocôndrias atingem sua capacidade máxima de armazenamento de cálcio, a adição adicional de cálcio desencadeia a abertura do poro de transição de permeabilidade mitocondrial (mPTP).
Essa abertura de poros libera cálcio das mitocôndrias para o tampão, onde se liga ao corante e causa aumento da fluorescência.
Determine a quantidade total de cálcio necessária para induzir a abertura do mPTP, que reflete a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial.
Preparar o meio de cloreto de potássio e adicionar o corante fluorescente verde de ligação ao cálcio até uma concentração final de 0,5 micromolar antes da experiência. Para determinar a capacidade de retenção de cálcio mitocondrial, primeiro transfira 1 mililitro de mitocôndrias isoladas em meio de cloreto de potássio contendo corante fluorescente verde de ligação ao cálcio de 0,5 micromolar para cada poço de uma placa de 6 poços.
Incube as mitocôndrias no corante fluorescente verde de ligação ao cálcio na placa de 6 poços à temperatura ambiente. Proteja-o da luz ambiente por 1 minuto. Após a incubação, adicione alíquotas de 4 microlitros de uma solução de cloreto de cálcio a 20 milimolares a cada poço da placa de 6 poços, usando a configuração de distribuição automática para introduzir 200 nanomoles de cálcio por miligrama de proteína mitocondrial.
Use um espectrômetro fluorescente para monitorar as mudanças de fluorescência a cada três segundos por 2 minutos, com um comprimento de onda de excitação de 506 nanômetros e um comprimento de onda de emissão de 531 nanômetros. A placa é equipada com agitação a 600 RPM por 3 segundos entre as leituras, controlada por software. Adicione uma alíquota adicional de 4 microlitros de solução de cloreto de cálcio 20 milimolares a cada poço e, em seguida, monitore as mudanças de fluorescência a cada 3 segundos por 2 minutos.