JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 5:13 min • April 28th, 2025
Pegue uma mosca de olhos brancos, anestesiada, transgênica e adaptada ao escuro.
A mosca expressa canais iônicos TRPL marcados com eGFP nos fotorreceptores do olho.
No escuro, o TRPL localiza-se nas membranas dos rabdômeros - as microvilosidades dos fotorreceptores.
Usando ar comprimido, empurre a mosca de cabeça para dentro de uma ponta de pipeta.
Apare a ponta e empurre a braguilha para trás.
Apare novamente e empurre a mosca para frente até que apenas sua cabeça se projete.
Imobilize a ponta em massa de modelar aderida a uma lâmina e coloque-a em uma platina de microscópio de fluorescência, com o olho voltado para a objetiva do microscópio radialmente.
Adicione uma gota de água à objetiva e abaixe-a até tocar o olho.
Capture imagens dos fotorreceptores.
Meça as intensidades de fluorescência nos rabdômeros, corpo celular e fundo.
Ilumine a mosca com luz laranja para induzir a translocação de TRPL para o corpo celular.
Repita as medições de imagem e fluorescência.
Compare as imagens para observar a fluorescência rabdomeral reduzida pós-iluminação, indicando translocação TRPL para o corpo celular.
Para preparar uma mosca em uma variação não letal, transfira a mosca anestesiada com gelo de cabeça para uma ponta de pipeta de 200 microlitros e empurre cuidadosamente a mosca em direção à ponta com ar comprimido. Em seguida, usando um bisturi, corte a ponta da pipeta bem na frente da cabeça. E usando uma pinça, empurre cuidadosamente a mosca alguns milímetros na ponta da pipeta.
Corte novamente a ponta da pipeta. E empurre a mosca de volta para a ponta com o ar comprimido, de modo que apenas a cabeça da mosca se projete da ponta da pipeta. Depois de colar um pedaço de plasticina em uma lâmina de objeto, pressione a ponta da pipeta de modo que o olho esquerdo ou direito fique voltado para cima. Certifique-se de que o olho esteja orientado corretamente sob o microscópio. Para aquisição de imagem, selecione uma objetiva de imersão em água.
No caso de uma variação não letal, use uma pipeta de laboratório para aderir uma grande gota de água gelada à parte inferior da objetiva de imersão em água. Coloque cuidadosamente a lâmina do objeto com a mosca preparada no microscópio stage. Em seguida, abaixe a objetiva de imersão em água manualmente até que ela entre em contato com a superfície da água ou o olho da mosca toque a gota.
Em seguida, mude o caminho da luz em direção à câmera do microscópio e gere uma imagem ao vivo. Reajuste o foco da câmera e avalie a orientação do olho, considerando que o olho deve estar voltado para a objetiva do microscópio radialmente. Use o software de tabela de pesquisa para detectar a supersaturação.
No caso de moscas não pigmentadas, ajuste o tempo de exposição de forma que os pixels mais brilhantes fiquem logo abaixo do limite de saturação para cada imagem. Grave uma imagem e salve-a como um arquivo bruto para arquivar todos os metadados correspondentes da gravação. Em seguida, exporte a imagem em um formato TIFF de pontos.
Para quantificar a fluorescência relativa do EGFP nos rabdômeros de micrografias de imersão em água, ajuste as configurações do ImageJ clicando em Analisar. Em seguida, defina as medidas e marque apenas a caixa para o valor médio de cinza. Importe a imagem TIFF de pontos clicando em Arquivo e depois em Abrir. Escolha uma região representativa da imagem em foco e amplie-a para 200% a 300% pressionando repetidamente Control e Plus juntos.
Em seguida, selecione a ferramenta Oval. E enquanto pressiona a tecla Shift, gere uma seleção circular na imagem que seja significativamente menor do que um rabdomere fluorescente. Em seguida, procure o tamanho exato exibido abaixo da barra de ferramentas na janela principal do ImageJ. Para medir as intensidades de fluorescência dentro da seleção circular, mova o círculo para o primeiro rabdomere com as teclas de seta do teclado e clique em Analisar e, em seguida, meça.
Uma janela de resultados listando o valor de cinza medido será exibida. Continue com as medições dos rabdômeros 2 a 6 e também meça o sinal de fundo. No caso de moscas não pigmentadas, faça medições adicionais das áreas do corpo celular correspondentes. Meça a fluorescência de mais dois omatídeos, resultando em três réplicas técnicas. Marque os omatídeos analisados usando a ferramenta lápis e salve esta imagem para documentação.
Selecione e copie os valores de cinza medidos da janela de resultados e cole-os no software de planilha para cálculos adicionais. Classifique os valores de intensidade de fluorescência de acordo com sua origem no rabdomere, corpo celular e fundo da categoria e calcule a intensidade média de cada categoria. Em seguida, calcule a quantidade relativa de EGFP presente no rabdomere, usando a primeira fórmula para olhos não pigmentados e a segunda para olhos pigmentados.