Geração de um modelo esferóide tridimensional de invasão de células tumorais

Pegue uma cultura de células tumorais cerebrais humanas.

Trate com uma enzima de dissociação para romper as junções celulares, separando as células agregadas.

Lave com um tampão para interromper a atividade enzimática e, em seguida, adicione um meio de cultura para manter a viabilidade celular.

Introduza metilcelulose, um agente de suspensão.

Transfira a suspensão para uma microplaca de fundo redondo e incuba.

A metilcelulose viscosa mantém as células suspensas, promovendo interações célula-célula para agregação em esferoides.

Misture os esferóides com uma matriz de colágeno que imita o ambiente extracelular fisiológico.

Transfira a suspensão para uma microplaca e incube, permitindo que a matriz forme um gel que aprisiona os esferoides.

Adicione o meio de crescimento em cima do gel.

Na periferia esferoide, as células tumorais perdem a adesão célula-célula e adotam um fenótipo invasivo.

Essas células secretam proteases para degradar a matriz, estendem saliências para se ancorar e avançar, invadindo a matriz.

O modelo esferóide exibindo invasão tumoral está pronto para análise.

Para gerar esferoides tumorais de tamanho uniforme, primeiro lave a cultura de células tumorais de interesse com 5 mililitros de PBS e trate as células com 0,5 a 1 mililitro de enzima de dissociação. Após 5 minutos a 37 graus Celsius, pare a reação com 4 a 4,5 mililitros de PBS e transfira as células destacadas para um tubo cônico de 15 mililitros, contendo 10 mililitros de meio de crescimento completo.

Após a contagem, ressuspenda as células em 1 vezes 10 elevado a 6 células por 8 mililitros de meio de crescimento completo, suplementado com 2 mililitros de concentração de metilcelulose a 2%, e transfira a suspensão para um recipiente estéril do sistema. Em seguida, adicione 100 microlitros de células a cada poço de uma placa de fundo redondo de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de dióxido de carbono a 37 graus Celsius e 5% por três a quatro dias.

Para realizar um ensaio de invasão, quando as células tumorais formarem esferóides de tamanho uniforme, transfira cada estrutura celular para um tubo de 500 microlitros e lave os esferóides uma vez com 200 microlitros de PBS. Após a segunda lavagem, transfira os esferóides cuidadosamente para 100 microlitros de matriz de colágeno recém-preparada e adicione cada suspensão esferóide no centro de cada poço de uma placa de fundo plano de 96 poços.

Após uma incubação de 30 minutos a 37 graus Celsius, adicione 100 microlitros de meio de crescimento completo em cima do gel em cada poço.

Certifique-se de colocar todos os esferóides no centro de cada poço para obter a melhor imagem da invasão de células tumorais.