JoVE Encyclopedia of Experiments
Neurociência
0 vistas • 3:47 min • April 28th, 2025
Comece com peptídeos derivados de grânulos de neuromelanina (NMGs) isolados de tecido cerebral humano post-mortem.
NMGs, encontrados em neurônios produtores de dopamina, contêm pigmento, proteínas e lipídios de neuromelanina.
Pegue uma coluna de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) contendo uma fase estacionária à base de sílica funcionalizada com ligantes hidrofóbicos.
Carregue os peptídeos na coluna.
Os peptídeos hidrofóbicos ligam-se mais fortemente à coluna do que os hidrofílicos.
Passe um buffer de eluição pela coluna.
Peptídeos menos hidrofóbicos eluem primeiro, enquanto os mais hidrofóbicos eluem depois.
Os peptídeos eluídos entram na fonte de ionização por eletrospray do espectrômetro de massa, onde são ionizados em íons peptídicos carregados.
Os peptídeos ionizados entram no analisador de massa, onde são separados com base em suas relações massa-carga.
Um íon peptídico selecionado é direcionado para a célula de colisão e fragmentado em íons menores, cujas relações massa-carga são medidas novamente.
Por fim, os dados são comparados a um banco de dados de referência para identificar as proteínas presentes na amostra de NMG.
Depois de realizar a digestão tríptica, conforme descrito no texto, prepare a amostra para análise HPLC-MS dissolvendo 200 a 400 nanogramas de peptídeos de amostra em um volume definido de 0,1% de TFA em entradas de frascos de vidro para espectrometria de massa inerte. Se a determinação da concentração não for aplicável devido a uma baixa quantidade de amostra, verifique o carregamento idêntico da amostra comparando a corrente total de íons.
Para iniciar a análise de dados brutos proteômicos, clique em Carregar para carregar os arquivos brutos no software. Clique em Definir experimento para atribuir os nomes de amostra. Para definir parâmetros específicos do grupo, adicione as modificações escolhendo Deamidation NQ, Oxidation M e Carbaminomethylation N-Term como modificações variáveis. E, em seguida, adicione a carbaminometilação C como modificação fixa. Escolha tripsina como enzima de digestão na guia de digestão.
Na guia Quantificação sem rótulos. Adicione a opção LFQ. E se mais de 10 arquivos forem processados, escolha a opção LFQ rápida para reduzir o tempo de processamento. Garantindo que todos os outros parâmetros específicos do grupo permaneçam nas configurações de fábrica, vá para a guia Parâmetros globais e adicione o arquivo FASTA derivado de uniprot.org na guia Sequências. Modifique a regra do identificador de acordo e adicione a ID de taxonomia 9606 para Homo sapiens.
Para quantificação de proteínas, escolha peptídeos únicos e de barbear. Em seguida, adicione a opção iBAQ como uma medida para quantificação de proteínas na guia Quantificação sem rótulo. Certifique-se de que todos os outros parâmetros globais permaneçam nas configurações de fábrica e clique em Iniciar. Depois que a análise for realizada com sucesso, recupere a saída .txt do grupo de proteínas.