Enciclopédia de Experimentos da JoVE
Neurociência
0 visualizações • 3:01 min. • April 28th, 2025
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p style='background-color:#ffffff;line-height:1.38;margin-bottom:0pt;margin-top:0pt;padding:0pt 0pt 12pt;text-align:justify;' dir='ltr'>Comece com uma placa de fundo plano com vários poços revestida com uma matriz de membrana basal, que contém polímero extracelular e proteínas de adesão que imitam a matriz do microambiente tumoral.Introduza uma mídia contendo uma neuroesfera de células de glioma derivadas de um tumor cerebral pediátrico, garantindo que ela esteja posicionada centralmente no poço.
A matriz promove a ligação da neuroesfera ao poço.
Adicione um reagente supressor de fundo para minimizar a fluorescência não específica.
Em seguida, introduza anticorpos anti-CD44 conjugados com fluoróforo verde.
Transfira a placa para um sistema de imagem de células vivas alojado dentro de uma incubadora que mantém as condições fisiológicas da célula.
Com o tempo, as células de glioma expressam a proteína de adesão celular CD44, que interage com as proteínas de adesão.
Isso ativa a via de sinalização celular e facilita a migração celular da neuroesfera.
Os anticorpos anti-CD44 conjugados com fluoróforo ligam-se ao CD44 expresso nas células do glioma, tornando-as fluorescentes.
O aparecimento de células fluorescentes verdes se afastando da neuroesfera confirma a migração das células de glioma.
Uma vez que os poços estejam revestidos com BMM, corte uma ponta P200. Pegue 50 microlitros do meio celular e NS de cada poço selecionado e transfira-o para um poço revestido, plano e de fundo. Verifique visualmente a presença e a posição do NS em cada poço. Adicione suavemente 50 microlitros do anticorpo BSR e ALR diluído a cada poço, esperando dois a três minutos para permitir que os reagentes se misturem. E usando um microscópio invertido, certifique-se de que a maioria dos NS replicados esteja localizada centralmente no poço. Depois de garantir a ausência de qualquer bolha, transfira suavemente a placa no instrumento de análise de células vivas, conforme demonstrado anteriormente.
No software do instrumento de análise de células vivas, selecione a opção Agendar para adquirir. Em seguida, clique na guia de adição e selecione Digitalizar na programação para digitalizar as placas com intervalos, conforme mencionado no manuscrito do texto. Na janela do software, crie ou restaure a embarcação e clique na opção Novo. Selecione o tipo de varredura de clonagem de diluição, objetivo 4X e fase e verde para o ensaio de migração. Selecione o tipo de placa e defina os poços a serem escaneados, destacando-os no mapa de placas. Em seguida, configure a frequência de varredura. Clique em Adicionar ao agendamento e inicie a verificação.